本文是一篇原创性研究论文（类型a），题为《Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection》，由Jun Xiao、Weiyun Li、Xin Zheng等学者合作完成，通讯作者为Bin Wei（weibinwhy@shu.edu.cn）和Hongyan Wang（hongyanwang@sibcb.ac.cn）。该研究发表于*Immunity*期刊，2020年1月14日出版，卷号为52，页码109–122。研究团队主要来自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所、武汉病毒研究所、上海大学、中国科学院上海营养与健康研究所、哈尔滨兽医研究所等机构。
胆固醇代谢与先天免疫之间的关联近年来受到广泛关注。已有研究表明，病毒或细菌感染可诱导巨噬细胞中胆固醇合成途径的下调，同时激活STING-TBK1-IRF3信号通路以促进I型干扰素（type I interferon，IFN-I）的产生。IFN-I反过来又能诱导胆固醇-25-羟化酶（cholesterol-25-hydroxylase，CH25H）的表达，将胆固醇转化为25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC），从而抑制多种病毒的复制与入侵。然而，胆固醇代谢网络中其他关键酶或天然代谢产物是否参与先天免疫调控，以及它们如何影响信号转导，仍不清楚。
7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterol reductase，DHCR7）是胆固醇生物合成最后一步的关键酶，催化7-脱氢胆固醇（7-DHC）转化为胆固醇。人类DHCR7突变会导致Smith-Lemli-Opitz综合征（SLOS），患者表现为发育迟缓、智力障碍和反复感染。尽管已知DHCR7缺乏会导致7-DHC堆积和胆固醇减少，但DHCR7在免疫系统中的功能尚未被充分阐明。本研究旨在探索DHCR7及其底物7-DHC在巨噬细胞抗病毒免疫反应中的作用，并揭示其调控IRF3活化的分子机制。
本研究采用了从体外细胞实验到体内动物模型的多层次研究策略，主要包括以下几个环节：
首先，研究者通过全基因组芯片分析和定量PCR筛选，检测了乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝细胞癌患者样本、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的小鼠肝脏和巨噬细胞中胆固醇代谢相关酶的表达变化。结果显示DHCR7和DHCR24在病毒感染的肝脏和巨噬细胞中均显著下调。随后，利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术检测了VSV感染小鼠肝脏中7-DHC和胆固醇的浓度变化。
其次，为验证DHCR7在抗病毒反应中的功能，研究者使用小干扰RNA（siRNA）沉默原代腹腔渗出巨噬细胞（peritoneal exudate macrophages，PEMs）中的DHCR7表达；利用CRISPR/Cas9系统构建了DHCR7缺失的RAW264.7巨噬细胞系；并通过Cre-loxP系统构建了巨噬细胞特异性DHCR7条件敲除小鼠（Dhcr7fl/flLyz2-cre+/−，简称Dhcr7-cKO）。这些模型被用于检测poly(I:C)刺激或VSV、仙台病毒（Sendai virus，SeV）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）感染后的Ifnb mRNA表达、IRF3和TBK1磷酸化水平以及病毒复制情况。此外，还构建了DHCR7过表达的RAW264.7细胞系以进行功能回复实验。
第三，为确定DHCR7酶活性对抗病毒功能的重要性，研究者使用了选择性DHCR7抑制剂AY9944和FDA批准的临床药物他莫昔芬（tamoxifen）。在PEMs和A549人肺泡上皮细胞中，检测了这些抑制剂对poly(I:C)、VSV、鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）和寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）感染后Ifnb表达、IRF3磷酸化及病毒清除的影响。ZIKV实验使用了GZ01/2016毒株，病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI）为5（用于检测Ifnb mRNA）或0.1（用于病毒滴度检测）。
第四，为探究DHCR7调控抗病毒效应的代谢基础，研究者比较了7-DHC积累与胆固醇减少对Ifnb产生的影响。使用Filipin III染色检测膜胆固醇水平，通过LC-MS定量细胞内7-DHC和胆固醇浓度。将PEMs与DHCR7缺失RAW264.7细胞的上清共培养，以模拟7-DHC的旁分泌效应；同时直接添加不同浓度的外源性7-DHC，检测其对Ifnb和Cxcl10表达、IRF3磷酸化及病毒清除的影响。
第五，为揭示DHCR7/7-DHC下游的信号通路，研究者检测了PI3K-AKT通路的活化状态。通过p85磷酸化水平、PIP3生成量评估PI3K活性，并使用PI3K抑制剂LY294002验证该通路的功能必要性。进一步，检测了AKT1、AKT2和AKT3在病毒感染或IFN-β刺激后的表达变化，利用siRNA沉默AKT1/AKT2或使用AKT3基因敲除小鼠的巨噬细胞，结合免疫共沉淀和免疫印迹检测AKT3的磷酸化及IRF3磷酸化水平。
第六，为明确AKT3对IRF3的直接调控机制，研究者进行了体外重组蛋白结合实验（His-IRF3与GST-AKT3）、免疫共沉淀实验、质谱分析鉴定IRF3的磷酸化位点，并通过定点突变（S385A、S386A、S173/175A、S188A）验证关键位点的功能。此外，利用IRF3缺陷的HEK293T细胞进行重建实验，以确定AKT3和TBK1对IRF3不同位点磷酸化的特异性贡献。
最后，在体内实验中，研究者对野生型小鼠腹腔注射AY9944（25 mg/kg，每日一次，连续3天），随后感染VSV-GFP或H1N1流感病毒，检测血清7-DHC和胆固醇浓度、血清IFN-β水平、组织病毒载量、生存率及肺组织病理变化。同时，利用Dhcr7-cKO小鼠和AKT3敲除小鼠验证DHCR7和AKT3在体内抗病毒防御中的功能。此外，通过骨髓过继转移实验，将CD45.2+的野生型或Akt3−/−骨髓细胞移植到亚致死剂量辐照的CD45.1+受体小鼠中，以确认免疫细胞中AKT3的作用。
DHCR7抑制IRF3活化与IFN-I产生。 在VSV感染的肝脏和巨噬细胞中，DHCR7的mRNA和蛋白水平均显著降低，同时7-DHC浓度升高而胆固醇浓度略有下降。在PEMs中，poly(I:C)、VSV、SeV、HSV、LPS、沙门氏菌和大肠杆菌等多种刺激均能下调DHCR7表达。siRNA沉默DHCR7或CRISPR/Cas9敲除DHCR7均显著增强poly(I:C)和VSV诱导的Ifnb表达。在Dhcr7-cKO巨噬细胞中，poly(I:C)、VSV、SeV和HSV诱导的Ifnb均大幅上调。机制上，DHCR7缺乏增强了IRF3 Ser396的磷酸化，但未影响TBK1 Ser172的磷酸化。DHCR7缺陷巨噬细胞中VSV-GFP的复制显著减少。相反，DHCR7过表达则抑制Ifnb产生和IRF3磷酸化，并促进病毒复制。这些结果表明DHCR7通过特异性调控IRF3而非TBK1的磷酸化来抑制抗病毒反应。
DHCR7抑制剂AY9944和他莫昔芬增强抗病毒功能。 AY9944处理可增加VSV或MCMV感染的PEMs中Ifnb表达和IRF3磷酸化，同时减少VSV-GFP的复制。特异性验证实验显示，AY9944可在野生型巨噬细胞中增强Ifnb，但在DHCR7缺失细胞中无进一步效应。他莫昔芬同样能促进poly(I:C)或VSV刺激后的Ifnb表达。在ZIKV感染的A549细胞中，AY9944和他莫昔芬均显著提高Ifnb表达，降低ZIKV拷贝数和空斑形成单位（plaque forming unit，PFU）。siRNA沉默DHCR7也能增强ZIKV感染的A549细胞中Ifnb产生并降低病毒滴度。
天然胆固醇前体7-DHC具有关键抗病毒作用。 DHCR7缺失或AY9944处理降低了巨噬细胞的总胆固醇和膜胆固醇水平，但显著升高了7-DHC浓度。添加可溶性胆固醇（MBCD-cholesterol）未能逆转DHCR7缺失增强的Ifnb产生，反而轻微抑制了VSV感染的巨噬细胞中Ifnb表达。将PEMs与DHCR7缺失RAW264.7细胞的上清共培养可促进Ifnb产生，且该上清中7-DHC（而非胆固醇）浓度显著升高。外源性添加7-DHC以剂量依赖方式增强poly(I:C)或VSV诱导的Ifnb和Cxcl10表达，促进MCMV和VSV感染后的Ifnb产生及IRF3 Ser396磷酸化，并减少病毒空斑形成和VSV-GFP荧光强度。
靶向DHCR7通过激活AKT3增强抗病毒反应。 7-DHC处理、AY9944处理或DHCR7缺失均增加了巨噬细胞膜胆固醇的可提取性，表明脂筏稳定性受到干扰。这些处理增强了PI3K调节亚基p85的磷酸化和PIP3生成，而PI3K抑制剂LY294002可阻断DHCR7缺失或AY9944增强的Ifnb、Cxcl10和Ccl2表达。在AKT家族中，AKT3的mRNA在静息巨噬细胞中几乎检测不到，但在poly(I:C)、SeV或IFN-β刺激后显著升高；IFN受体缺陷（Ag6）巨噬细胞无法在SeV感染后上调AKT3。在沉默AKT1和AKT2或使用AKT2缺陷且沉默AKT1的细胞中，AY9944和7-DHC均能明显增强VSV感染后的AKT3磷酸化。AKT3沉默或缺失显著降低VSV、HSV和SeV诱导的Ifnb和IRF3磷酸化，并削弱病毒清除能力。更重要的是，AKT3缺陷使AY9944或7-DHC诱导的Ifnb增强效应基本消失。
7-DHC/DHCR7模块通过AKT3直接磷酸化IRF3 Ser385。 AKT3缺陷或沉默显著降低了IRF3 Ser396磷酸化、核转位和二聚化。体外重组蛋白结合实验和免疫共沉淀实验均证实AKT3与IRF3直接结合，且VSV感染可增强内源性AKT3-IRF3结合，而TBK1过表达不影响该相互作用。质谱鉴定发现IRF3的Ser173、Ser175、Ser188、Ser386和Ser385可能是AKT3的磷酸化位点。定点突变实验显示，S385A和S386A突变可阻断AKT3和TBK1诱导的IRF3活化。进一步分析表明，TBK1单独过表达主要增强IRF3 Ser386磷酸化，对Ser385影响甚微；而AKT3单独过表达则可增强Ser385磷酸化。AKT3和TBK1共表达可进一步增强Ser386和Ser396磷酸化及IRF3二聚化。在AKT3缺陷巨噬细胞中，VSV感染诱导的IRF3 Ser385磷酸化受损，而7-DHC处理或DHCR7缺失可增强野生型巨噬细胞中IRF3 Ser385磷酸化，但在AKT3缺陷细胞中7-DHC无法进一步增强该磷酸化。这些结果证明AKT3是IRF3 Ser385的关键激酶，与TBK1介导的Ser386磷酸化协同促进IRF3完全活化。
体内DHCR7抑制剂AY9944保护小鼠免受多种病毒感染。 AY9944处理的小鼠血清7-DHC升高、胆固醇降低，血清IFN-β浓度增加，VSV在血清和肝脏中的载量减少，生存率提高，肺组织损伤减轻。AY9944还能保护小鼠免受H1N1感染，表现为体重下降减少、肺损伤减轻和生存率提高。巨噬细胞特异性DHCR7缺失小鼠在VSV感染后血清IFN-β升高，生存率改善。相反，Akt3−/−小鼠在VSV或脑心肌炎病毒（EMCV）感染后IFN-β产生减少，死亡率升高，肝脏和脾脏病毒载量增加，组织损伤加重。骨髓过继转移实验进一步证实，免疫细胞中AKT3的缺失可削弱受体小鼠的抗病毒防御能力。
本研究揭示了DHCR7作为胆固醇代谢与先天免疫之间的关键连接点。病毒或病原体感染可下调巨噬细胞中DHCR7表达，导致其底物7-DHC积累。7-DHC通过干扰脂筏稳定性激活PI3K-AKT3通路，诱导的AKT3直接结合并磷酸化IRF3 Ser385，协同TBK1介导的Ser386磷酸化，促进IRF3二聚化和完全活化，从而增强IFN-I产生和抗病毒免疫。DHCR7抑制剂AY9944和他莫昔芬以及天然产物7-DHC在体外和体内均能有效抑制多种RNA和DNA病毒的感染。
该研究的科学价值在于：首次阐明了DHCR7/7-DHC模块在先天免疫中的调控功能，揭示了一种全新的IRF3磷酸化调控机制——AKT3作为IRF3 Ser385的特异性激酶，与TBK1协同实现IRF3完全活化。在应用价值方面，研究提出DHCR7抑制剂（包括FDA批准的药物他莫昔芬）和7-DHC可能是针对新发或高致病性病毒的潜在治疗策略。特别是他莫昔芬在乳腺癌和卵巢癌治疗中的广泛应用，提示其可能对合并HPV感染的乳腺癌患者具有额外的治疗益处。此外，研究还提示未来应开发针对不同AKT亚型的特异性抑制剂，以更精准地应用于病毒相关肿瘤的临床治疗。
本研究的主要亮点包括：一是发现DHCR7缺乏和7-DHC处理通过PI3K-AKT3通路特异性增强IRF3（而非TBK1）的磷酸化；二是首次证明AKT3直接结合IRF3并磷酸化其Ser385位点，这是IRF3完全活化所必需的；三是证明靶向DHCR7可在体内保护小鼠免受多种病毒感染，包括VSV、H1N1和ZIKV；四是提出DHCR7抑制剂（包括临床药物他莫昔芬）和天然产物7-DHC作为广谱抗病毒治疗的新策略。这些发现不仅拓展了胆固醇代谢与免疫调控交叉领域的认知，也为开发新型抗病毒药物提供了重要的理论依据和实验支持。