学术研究报告：将ISCB和Cas9转化为RNA引导的RNA编辑器

作者及机构
本研究由Chengtao Xu、Xiaolin Niu、Haifeng Sun（耶鲁大学分子生物物理与生物化学系）、Hao Yan、Weixin Tang（芝加哥大学化学系及生物物理动力学研究所）和Ailong Ke（耶鲁大学，通讯作者）共同完成，发表于Cell期刊2025年10月16日刊。

学术背景
RNA编辑是基因治疗的重要替代方案，因其不改变基因组DNA，可避免遗传性脱靶风险。当前主流工具CRISPR-Cas13虽能实现RNA靶向编辑，但其附带RNA切割活性（collateral RNA cleavage）会导致真核细胞毒性，阻碍临床应用。ISCB是Cas9的进化祖先，体积更小且缺乏Cas9的Rec结构域，但保留了相似的DNA切割机制。本研究旨在通过工程化改造ISCB，开发一种无细胞毒性的高效RNA编辑平台，并探索其应用于剪接调控、RNA切割及碱基编辑的潜力。

研究流程与实验设计

1. ISCB的RNA结合特性验证

   • 实验对象：来自O. geu菌的ISCB蛋白及其ωRNA复合体（RNP）。
     
   • 方法：通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证ISCB对单链DNA（ssDNA）和RNA（ssRNA）的亲和力，发现其与互补ssDNA/ssRNA结合紧密（解离常数Kd < 32 nM），但对双链DNA（dsDNA）偏好更强（竞争实验显示dsDNA可完全取代ssRNA结合）。
     
   • 关键发现：野生型ISCB的DNA结合活性由靶标相邻基序相互作用域（TID, Target-adjacent motif Interaction Domain）介导，删除TID后（构建ΔTID突变体），dsDNA结合能力丧失，而ssRNA结合保留。

2. 工程化r-ISCB的开发

   • 构建策略：删除TID域（aa433-487）或替换为大肠杆菌PNPase的S1结构域（非特异性ssRNA结合模块）。
     
   • 验证实验：单分子荧光实验显示，r-ISCB（ΔTID）与ssRNA结合半衰期达37分钟，亲和力达皮摩尔级（Kd = 29 pM），且通过种子序列（seed sequence）实现高特异性识别（2个碱基错配即显著降低结合）。
     
   • 对比分析：r-ISCB的靶标搜索机制与Cas9类似（依赖A型构象种子区），优于Cas13的自由浮动引导机制。

3. 剪接调控应用

   • 靶标基因：人类PKM基因（调控PKM1/PKM2异构体）和PCSK9基因（胆固醇代谢关键因子）。
     
   • 设计：针对PKM外显子10的5’或3’剪接位点设计8种引导RNA（gRNA），转染HEK293T细胞。
     
   • 结果：gRNA-m2使PKM2表达降低至对照的33%，且PKM1不受影响；30 nt长gRNA进一步将PKM2/PKM1比率降至24.9%。PCSK9靶向实验中，gRNA-k3使mRNA水平降低2倍，与RNAi疗效相当。

4. RNA编辑与转剪接

   • A-to-I编辑：将r-ISCB与ADAR2（腺苷脱氨酶）融合，在mRNA中实现腺苷（A）至肌苷（I）的转换。荧光报告系统显示，编辑位点与引导序列间距30 nt时效率最高（71.1%细胞显示校正荧光）。
     
   • 转剪接：通过靶向内含子的r-ISCB将外源功能性外显子插入缺陷型EGFP基因，成功修复荧光信号（效率达40.9%）。
     

5. Cas9的RNA编辑转化

   • 策略扩展：在Nmecas9、Sacas9等四种Cas9中删除PAM相互作用域（PID），成功将其转化为RNA靶向工具（r-Cas9）。其中，Cas9d（仅700 aa）表现最优，敲低效率达对照的9.6%。

主要结果与逻辑关联
- 无毒性优势：r-ISB在HEK293T细胞中无显著细胞毒性，而Cas13导致生长抑制（图S4f-g）。
- 高效性：r-ISB在DMD基因外显子51跳读中效率达Cas13的6-8倍（图3k），且转录组测序未检测到显著脱靶（图5h）。
- 机制创新：TID/PID删除解除DNA结合“锁”，使RNA靶向活性主导（图2c-f）。

结论与价值
本研究首次将ISCB转化为高效RNA编辑平台r-ISCB，其无毒性、高精度及多功能性（剪接调控、碱基编辑、转剪接）为基因治疗提供了新工具。科学价值在于揭示了RNA/DNA结合活性的结构调控机制，应用潜力包括：
1. 治疗优势：单次AAV递送可实现长期疗效，适用于杜氏肌营养不良（DMD）等遗传病。
2. 平台扩展性：同类方法可改造Cas12等其他核酸酶，推动CRISPR 2.0发展。

研究亮点
1. 创新改造策略：通过结构域删除（TID/PID）而非点突变实现功能转换。
2. 性能超越Cas13：种子序列机制带来更高靶向效率，且无附带切割活性。
3. 多功能性：首次在同一平台集成剪接调控、转剪接和碱基编辑。

其他价值
- 临床转化潜力：r-ISCB的小体积（ kb）适合AAV包装，为体内递送提供便利。
- 技术普适性：研究证实类似策略可推广至Cas9家族，为开发更多RNA编辑器奠定基础。

（注：文中术语首次出现时标注英文，如“电泳迁移率变动分析（EMSA）”。）