基于纳米抗体的重组抗蛇毒血清用于治疗眼镜蛇、曼巴蛇和唾蛇咬伤

主要作者与发表信息

本研究由丹麦技术大学（Technical University of Denmark）的Timothy P. Jenkins、Anne Ljungars和Andreas H. Laustsen作为通讯作者，联合墨西哥国立自治大学、英国利物浦热带医学院、美国斯克里普斯研究所等多个国际研究机构共同完成。论文于2025年10月29日在线发表于Nature期刊（第647卷，2025年11月20日刊），标题为“Nanobody-based recombinant antivenom for cobra, mamba and rinkhals bites”。

学术背景

蛇咬伤中毒（snakebite envenoming）是被忽视的热带病，撒哈拉以南非洲每年估计发生超过30万起蛇咬伤事件，导致超过7000人死亡和10000例截肢，实际数字可能高达五倍。目前唯一的特异性治疗方法是来源于超免疫大型动物（如马）血浆的传统抗蛇毒血清（antivenom）。然而，这类抗蛇毒血清存在批次间差异大、生产成本高、跨种属效力有限以及可能引发免疫不良反应等缺陷。此外，现有抗蛇毒血清中真正具有治疗活性的抗体成分可能低至10%，因此需要大剂量给药。更严重的是，传统抗蛇毒血清在减轻局部组织损伤（如皮肤坏死）方面往往效果不佳，这是导致截肢的重要原因。

撒哈拉以南非洲共有18种最具医学重要性的眼镜蛇科（elapid）毒蛇，分属三个属：曼巴蛇属（Dendroaspis，4种）、唾蛇属（Hemachatus，1种）和眼镜蛇属（Naja，13种，进一步分为Uraeus、Boulengerina和Afronaja三个亚属）。这些蛇毒的临床表现差异显著：曼巴蛇和某些眼镜蛇主要引起神经毒性症状，而唾蛇和非洲喷毒眼镜蛇则主要造成严重的局部组织损伤。本研究的目标是开发一种基于重组纳米抗体（nanobody，即VHH）的广谱抗蛇毒血清，能够中和这些蛇毒中的关键毒素家族，实现对撒哈拉以南非洲所有医学相关眼镜蛇科毒蛇的全面覆盖。

详细工作流程

本研究的整体流程包括以下主要步骤：毒蛇毒素鉴定与纯化、免疫骆驼科动物并构建噬菌体展示文库、通过噬菌体展示筛选获得广谱中和VHH、体外与体内功能性验证、实验性重组抗蛇毒血清的设计与体内效力评估。

研究团队首先基于前期蛋白质组学工作，确定了18种眼镜蛇科毒蛇毒液中最具医学相关性的毒素，这些毒素分属三个蛋白家族：三指毒素（three-finger toxins，3FTx）、磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Kunitz-type serine protease inhibitors，KUN）。通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）从粗毒中分离纯化毒素，并对47个预期含关键毒素的组分进行了蛋白质组学分析。最丰富的3FTx属于五个亚家族：I型α-神经毒素（short-chain neurotoxin，SNTX）、II型α-神经毒素（long-chain neurotoxin，LNTX）、I型细胞毒素（cytotoxin，CTX）、孤儿组XI（orphan group XI，OG XI）和胺能毒素（aminergic toxin，AGTX）。最终选取了16个毒液组分（3个LNTX、3个SNTX、2个KUN、2个OG XI、1个AGTX、1个PLA2和4个CTX）作为噬菌体展示筛选的靶标。

在免疫方面，研究人员用18种毒蛇毒液的混合物对一只羊驼（alpaca）和一只美洲驼（llama）进行了皮下免疫。注射剂量在8个时间点内每两周递增，并在首次免疫后第52、54和60周额外进行了三次加强免疫。在不同免疫时间点采集血液样本，构建了三个独特的VHH展示噬菌体文库。在噬菌体展示筛选过程中，采用了交叉淘选策略（cross-panning），例如使用来自不同蛇种的SNTX组分进行交替筛选和/或在连续轮次中递减抗原浓度，以富集具有广谱交叉反应性和/或高亲和力的VHH。

筛选后，从15个噬菌体池输出中亚克隆并在大肠杆菌中表达了超过3000个单克隆VHH，使用表达归一化捕获解离增强镧系荧光免疫分析（DELFIA）筛选其与同源靶毒素的结合。约60%的VHH能结合其靶毒素。对其中25%的克隆进行二次DELFIA交叉反应性筛选，发现超过50%的VHH能结合同一毒素（亚）家族的多种毒素。经测序鉴定获得超过100个独特的VHH克隆。随后对前21个独特交叉反应性VHH进行剂量-反应DELFIA分析，EC50值在1 nM至15 nM之间。选取前15个VHH进行生物膜干涉技术（biolayer interferometry，BLI）测定结合动力学，所有测试的VHH对大多数靶毒素均表现出低纳摩尔级亲和力（KD），且解离速率较慢（koff < 5.5 × 10⁻⁴ s⁻¹）。

在体外中和实验中，通过全细胞膜片钳技术评估了抗LNTX和抗SNTX的VHH对烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）电流的保护作用。结果显示这些VHH在VHH与毒素的摩尔比为1:1时即可完全抑制神经毒性。对于细胞毒性，使用角质形成细胞系进行细胞活力测定，评估抗CTX VHH和抗PLA2 VHH对细胞毒性的中和能力。结果显示两个抗CTX VHH对所有七种Afronaja毒液的细胞毒性具有广泛的保护作用（分别提供75–95%和50–85%的保护），而抗PLA2 VHH在细胞实验中对所测毒液几乎没有中和作用，但在酶活性测定中能完全抑制Afronaja毒液中的PLA2活性。

基于体外中和结果，研究者进行了WHO推荐的小鼠预孵育实验以评估体内保护效果。首先测定了毒液组分、毒素和全毒的静脉注射半数致死量（LD50）。通过一系列逐步升级的实验——从单一纯毒素或毒素组分的中和，到简单全毒的中和，再到复杂全毒的中和——最终选择了8种先导VHH，靶向7个医学重要的毒素亚家族，组成了实验性多价重组抗蛇毒血清。

为阐明8种先导VHH广谱中和的结构基础，研究者采用共结晶、冷冻电镜和计算机模拟结构预测等方法确定了VHH与靶毒素的结合界面。值得注意的是，VHH1抗CTX为双表位结合（biparatopic），可能解释了其优于VHH4抗CTX的细胞毒性中和能力。

在最终的体内效力评估中，研究者首先进行了18种毒液的预孵育实验：将3倍LD50的毒液与固定剂量的重组抗蛇毒血清（确保每个靶向毒素亚家族与对应VHH的摩尔比至少为1:10）预孵育后静脉注射给小鼠，每组5只。随后进行了更严格的解救实验（rescue model）：使用11种代表性毒液皮下注射3倍LD50后，5分钟后静脉给予重组抗蛇毒血清，以更好地模拟真实蛇咬伤场景。同时以市售的Inoserp Pan-Africa抗蛇毒血清作为对照，按制造商推荐剂量使用。此外，研究者还评估了抗蛇毒血清对皮肤坏死的预防效果，包括预孵育模型和两种解救模型（皮内局部给药和静脉给药）。

主要结果

在预孵育实验中，重组抗蛇毒血清预防了除东部绿曼巴蛇（Dendroaspis angusticeps）以外所有17种毒液引起的致死效应。其中13种毒液处理后小鼠未观察到任何明显的中毒症状；黑颈喷毒眼镜蛇（Naja melanoleuca）和西非绿曼巴蛇（Dendroaspis viridis）处理后仅出现轻微中毒症状（闭眼和间歇性嗜睡）；黑曼巴蛇（Dendroaspis polylepis）处理后出现短暂严重嗜睡但1–2分钟后消失。对于东部绿曼巴蛇毒液，该血清虽然延长了小鼠存活时间至3–6小时，但未能完全防止死亡，推测是因为该毒液富含毒蕈碱毒素和束状蛋白等未被靶向的毒素。

在解救实验中，重组抗蛇毒血清完全防止了Naja haje、Naja annulifera、Naja nivea、Naja senegalensis、Naja nubiae和Hemachatus haemachatus毒液引起的致死，且小鼠无异样表现。对于Dendroaspis viridis毒液，也能完全防止死亡，但小鼠在约4小时后出现活动受限等症状。对于Naja melanoleuca毒液，显示出部分中和效果，5只小鼠中3只存活。然而，对于Dendroaspis polylepis和Dendroaspis jamesoni毒液，重组抗蛇毒血清仅延长了死亡时间（分别从约0.5小时延长至2小时和1小时），对Dendroaspis angusticeps毒液则无保护作用。值得注意的是，在解救实验中，Inoserp Pan-Africa抗蛇毒血清对所有测试毒液仅显示出部分中和效果，表明除黑曼巴蛇外，重组抗蛇毒血清在所测剂量下均优于市售抗蛇毒血清。

在皮肤坏死实验中，使用三个VHH（VHH1抗CTX、VHH4抗CTX和VHH20抗PLA2）的混合物在预孵育和皮内解救模型中均显著减小了Naja mossambica、Naja nigricollis和Hemachatus haemachatus毒液引起的皮肤坏死面积。当用完整的8-VHH重组抗蛇毒血清在静脉解救模型中进行测试时，在48小时终点处减小了三种毒液引起的坏死面积，但对Naja nigricollis的效果具有统计显著性。相比之下，Inoserp Pan-Africa抗蛇毒血清对Naja nigricollis毒液的坏死面积减小幅度较小且不显著。

结论与价值

本研究证明，仅需8种靶向7个不同蛋白亚家族的VHH，即可构建一种对撒哈拉以南非洲所有医学相关眼镜蛇科毒蛇（除东部绿曼巴蛇外）具有体内保护效力的多价重组抗蛇毒血清。这一发现挑战了传统观点，即只有多克隆抗体才能克服蛇毒的复杂性，回答了毒素学领域长期存在的问题：开发具有临床应用价值的重组抗蛇毒血清究竟需要多少种抗体。研究证实，通过蛋白质组学分析可以解析蛇毒的复杂组成，并确定需要中和的关键毒素，从而指导有效抗蛇毒血清的开发。

在应用价值方面，VHH形式具有多项潜在优势：临床上已验证的低免疫原性有助于提高安全性；高生物物理稳定性可能延长保质期，便于在高温高湿条件下储存；小尺寸使其能够快速从血液分布到周围组织，中和咬伤部位或作用位点的毒素；单位质量的中和能力优于全长IgG；且可采用低成本微生物表达系统生产，有望降低治疗成本，提高抗蛇毒血清在低收入和中等收入国家的可及性。本研究还首次证明VHH可通过延迟局部给药显著减轻由不同眼镜蛇科蛇毒引起的皮肤坏死，为改善蛇咬伤患者的高致残率带来了希望。

研究亮点

本研究的主要亮点包括：首先，成功构建了首个对非洲大陆范围内17种医学相关眼镜蛇科毒蛇具有体内保护效力的重组抗蛇毒血清，物种覆盖广度前所未有；其次，仅使用8个VHH即实现了如此广泛的覆盖，充分证明了“以毒素为中心”的开发策略的可行性；第三，该重组抗蛇毒血清在解救模型中表现优于市售的抗蛇毒血清Inoserp Pan-Africa；第四，首次展示了VHH在减轻蛇毒引起的皮肤坏死方面的治疗潜力，而这是传统抗蛇毒血清长期无法有效解决的临床难题，具有重要的转化医学价值。此外，研究者还首次报道了VHH对CTX的双表位结合模式，这一发现为理解VHH的广谱中和机制提供了新的结构生物学见解。