本研究由法国马赛第二大学（Faculté des Sciences de Luminy）生物催化与精细化学课题组（Groupe “Biocatalyse et Chimie Fine”）的S. Pedragosa-Moreau、C. Morisseau、J. Baratti、J. Zylber、A. Archelas和R. Furstoss等人完成。该研究成果发表于1997年的《Tetrahedron》期刊第53卷第28期，页码9707-9714，文章标题为”微生物转化37：利用化学-酶法组合策略对映体汇聚合成β-阻断剂®-Nifenalol®”（Microbiological Transformations 37. An Enantioconvergent Synthesis of the β-blocker ®-Nifenalol® Using a Combined Chemoenzymatic Approach）。该工作曾于1995年在英国Warwick举行的Biotrans 95大会及1996年在瑞士Zermatt举行的国际生物技术工业精细化学品生产会议上首次报告。
手性邻二醇（optically enantiopure vicinal diols）的对映体纯形式合成是当今不对称合成领域最活跃的研究课题之一，这类化合物是众多生物活性分子合成中的高价值手性合成子（chiral synthons）。文献中已报道多种制备方法，包括使用Jacobsen的Salen锰或铬催化剂直接氧化烯烃前体，以及Sharpless锇催化不对称二羟基化反应等。然而，这些方法存在若干局限性：底物适用范围有限，某些底物的对映体过量值（enantiomeric excesses, ee）仅为中等或较差；使用重金属催化剂可能带来工业污染问题；且这些方法受专利保护，工业应用需支付专利许可费。
生物催化方法为此类手性合成子的制备提供了另一条有吸引力的途径。其中，环氧化物水解酶（epoxide hydrolases, EHs）是近年来备受关注的新型酶类。这类酶能够有效区分内消旋底物的伪不对称中心，并可对映选择性地水解各种外消旋环氧化物，从而获得对映体纯的未反应底物及相应的邻二醇产物。在某些情况下，酶对两种底物对映体表现出不同的区域选择性，可实现单一对映体的对映体汇聚（enantioconvergent）合成，理论收率可达100%。然而，已研究的大多数环氧化物水解酶来源于哺乳动物，其可获得性低，严重限制了用于克级规模的制备。
研究团队此前发现，某些真菌如黑曲霉（A. niger）和Sulfurescens菌（B. sulfurescens）能够对映选择性地水解多种环氧底物。在苯乙烯氧化物（styrene oxide）的水解中，这两种真菌表现出对映互补性（enantiocomplementary）：A. niger优先水解®-对映体，而B. sulfurescens优先水解(S)-对映体；有趣的是，由于亲核攻击的区域选择性不同，两者均生成®-绝对构型的邻二醇。这为利用混合真菌体系实现对映体汇聚反应（理论收率100%）奠定了基础。然而，这一策略并非对所有底物都适用。
本研究的目标分子Nifenalol® 1是一种具有抗心绞痛和抗心律失常活性的β-肾上腺素阻断剂（β-adrenergic blocker），且仅其®-对映体具有生物活性。本研究的目的是开发一种化学-酶法组合策略，克服传统动力学拆分50%理论收率的限制，实现®-Nifenalol®的高效制备。
研究者首先探索了以对硝基苯乙烯氧化物（para-nitrostyrene oxide）2的外消旋体为底物，分别使用A. niger和B. sulfurescens全细胞催化水解的可行性。
实验程序一：对映选择性水解的初步研究
实验面临的首要问题是底物2在水相介质中的溶解度极低。通过预实验筛选，研究者测试了DMF、DMSO、丙酮、乙腈和乙醇等多种有机共溶剂，最终确定DMSO或DMF效果最佳。因此，分析实验采用将底物2的DMF溶液（终浓度1% v/v）添加到含有适当真菌的缓冲液（pH 8）全细胞悬浮液中的方式进行。
关键发现： - A. niger催化水解：反应1小时后，未反应环氧物2的ee值超过98%（收率约30%），同时生成的邻二醇3的ee值为约70%（收率约54%）。 - B. sulfurescens催化水解：该真菌催化的水解反应极其缓慢，反应24小时后仅生成约36%的二醇3，且其ee值仅为49%。
结论：B. sulfurescens对此底物的低活性表明，此前基于两种真菌同时使用以实现对映体汇聚的既定方法不适用于该底物，无法使二醇3的收率超过50%。
实验程序二：A. niger催化动力学的放大制备
基于上述结果，研究者选择了利用A. niger催化动力学拆分（kinetic resolution）途径进行放大制备。具体操作为：使用5克外消旋环氧物2为底物，在1升含40克细胞（干重）的缓冲溶液（5% DMF浓度）中进行反应。反应通过手性气相色谱（chiral GC）实时监测，当剩余环氧物的ee值达到95%时终止反应（约2小时）。经标准后处理和快速色谱（flash chromatography）分离，得到： - (S)-2环氧物：1.9克，收率38%，ee值为96%。 - ®-3邻二醇：2.7克，收率49%，ee值为66%。
进一步纯化：获得的®-3二醇可通过氯仿重结晶，得到1.7克（收率32%）对映体纯产物（ee>98%）。
为克服动力学拆分固有的50%收率损失限制，研究者设计了一条创新性的组合策略：将A. niger催化的对映选择性酶水解与剩余(S)-2环氧物的酸催化水解（acid-catalyzed hydrolysis）相结合，实现一锅法（one-pot process）对映体汇聚合成。该策略的原理是基于在苄位碳原子（stereogenic benzylic carbon atom）上发生构型翻转（inversion of configuration），从而使(S)-2环氧物转化为所需的®-3二醇。
数学模型的推导：
由于最终二醇的ee值直接依赖于转化率，而转化率的精确控制并非直观可预测，因此研究者借鉴了此前lipase/Mitsonobu组合方法的数学处理思路（基于Sih理论），开发了适用于其环氧水解酶（EH）/酸催化组合过程的数学模型。
关键参数确定： 1. 酶促反应的E值测定：通过测量数个转化率（conversion ratios, c）下残留环氧物（eeS）和生成二醇（eeP）的ee值，研究者先前已测定该反应的E值约为40。 2. 酸催化水解的立体选择性测定：纯(S)-2在DMF/水溶液中经硫酸（H2SO4）小心的酸水解，得到了ee值为80%的所需®-3二醇。这表明约20%的对映体纯度损失（即该步骤中有10%的错误对映体生成）。设化学翻转（chemical inversion, x）参数为x=0.9。
数学模型公式体系：
研究者构建了一个理论方案（Scheme 3），详细定义了环氧物两对映体在酶水解和后续酸水解过程中各物种的浓度变化，包括保留（retention）和翻转（inversion）途径。在此基础上推导出核心方程式：
模型应用：以E=40代入方程式(6)，得出酸水解应在残留环氧物eeS达到约95%时进行。根据方程式(5)或(7)（x=0.9），预期最终二醇eef可达约80%。
基于上述数学模型的指导，研究者实施了组合酶促/酸催化水解的制备规模实验。
实验程序三：全细胞一锅法过程
微生物全细胞步骤跟踪反应进展，当残留(S)-2环氧物ee值达到95%时（2.5小时），将反应容器迅速冷却至10°C，缓慢加入18N硫酸溶液。继续在低温下搅拌16小时以完成酸水解。经后处理，获得了预期结果：®-3二醇收率90%，ee值为83%。重结晶后得到73%收率的光学纯产物。
由于全细胞培养体系的异质性和内在低比活性（specific activity），研究者进一步开发了使用部分纯化酶提取物的改进方案。基于其先前工作，研究者制备了来自A. niger的水溶性酶提取物（enzymatic extract），该提取物的酶活性约为培养菌丝体（干重）的20倍。该提取物经冻干（lyophilized）处理后得到粉末，可在4°C储存数月而无明显活性损失（%）。从5升发酵罐培养可获得总计400毫克酶粉末，对环氧底物2的总活性为174 U/g。
实验程序四：可溶性酶提取物催化过程
将相当于27 U的酶提取物（175 mg粉末）溶解于18.5 mL DMF/水（20/80）溶液中，加入1 g（330 mM）外消旋环氧物2（底物浓度53 g/L）。反应26小时后，残留环氧物ee值达95%。随后加入25 mL DMF以终止酶促反应并完全溶解残留环氧物。将体系冷却至-20°C后，加入18N硫酸并继续搅拌20小时。待残留环氧物消失并经中和后处理，分离得到1.04克®-二醇3（收率94%），ee值为80%。氯仿重结晶得到0.81克对映体纯产物。
步骤一：®-3的环氧环化
采用类似于Golding等人报道的方法，将光学纯的®-3二醇（0.81克）通过在醋酸中与溴化氢反应生成相应的乙酰氧基溴化物，进一步环化得到对映体纯的®-2环氧物，收率89%（0.65克），且对映体纯度未损失。
步骤二：环氧物的区域选择性胺解开环
将所得®-2环氧物（1克）溶解于无水乙醇（10 mL），加入异丙胺（isopropylamine）（1.77克）。在室温下搅拌72小时后，环氧物全部消耗，异丙胺完全区域选择性地进攻环氧环（oxirane moiety）位阻较小的碳原子。经快速色谱纯化，得到®-Nifenalol® 1（1.2克，收率90%），为橙色固体，熔点为118-121°C。进一步溶解于无水乙醚并通入HCl气体制得其盐酸盐，为白色固体，熔点208-211°C，比旋光度[α]²⁰ᴅ = -40.3（c 1.07, H₂O），与文献报道值（mp 217-218°C，[α]²⁰ᴅ = -41（c 2, H₂O））一致。
该研究明确了以对硝基苯乙烯氧化物2为底物时，A. niger和B. sulfurescens表现出的不同水解效率是决定合成策略的关键因素。具体而言，B. sulfurescens对此底物的水解极缓慢（24小时仅36%转化率，ee值仅49%），而A. niger则展现出高效的(S)-对映选择性和不错的E值（~40），1小时内可达到>98% ee值。这一差异意味着无法利用两种真菌的对映互补活性实现底物2的对映体汇聚水解，迫使研究者寻求替代策略。
通过结合A. niger的(S)-选择性酶水解和剩余®-环氧物（实为(S)-2）的酸催化立体翻转水解，成功实现了对映体汇聚转化。最终得到®-3二醇，其ee值和收率与数学模型预测高度吻合： - 全细胞过程：收率90%，ee值83%（预期约80%）； - 酶提取物过程：收率94%，ee值80%（预期约80%）。
此结果验证了所建立的数学模型的正确性和实用性。
从外消旋对硝基苯乙烯氧化物出发，经四步合成路线（包括动力学拆分步骤），最终以58%的总收率获得对映体纯的®-Nifenalol® 1。考虑到这是基于拆分策略的合成，该总收率相当可观。具体步骤收率如下： - 酶促/酸催化组合水解制备®-3：90-94%收率（ee 80-83%）； - 重结晶纯化：约80%回收率得到光学纯®-3； - 环化制备®-2：89%收率（对映体纯度保留）； - 胺解开环制备®-Nifenalol®：90%收率。
本研究首次建立了化学-酶法组合策略，通过将真菌环氧化物水解酶的对映选择性水解与酸催化立体翻转水解相结合，成功解决了传统动力学拆分收率受限的瓶颈问题。研究展现了数学建模在优化组合化学-酶法过程中的重要价值，通过推导通用方程（方程式5-7），可以精确预判最优反应控制节点，这一方法学具有普适性，可推广应用于其他底物的类似转化过程。此外，使用可溶酶提取物替代全细胞体系，显著提升了过程的均相性和可操作性，大幅提高了底物浓度（53 g/L），为潜在的工业放大奠定了基础。
®-Nifenalol®作为一种具有抗心绞痛和抗心律失常活性的β-肾上腺素阻断剂，其®-对映体的高效制备具有潜在的制药工业价值。与已报道的经二苯甲酰酒石酸衍生物拆分的方法相比，本方法的创新意义在于： 1. 使用生物催化方法，避免了重金属催化剂的使用，减少了环境污染风险； 2. 不涉及受专利保护的重金属催化的不对称合成工艺，避免了工业应用中的专利许可费问题； 3. 通过自建数学模型精确调控反应进程，以动力学拆分策略实现了接近对映体汇聚的收率水平； 4. 所开发的酶提取物具有长期储存稳定性和高活性的优点，便于实际应用。
本研究最突出的创新之处在于建立了环氧化物水解酶酶促水解与后续酸催化立体翻转水解相结合的对映体汇聚合成策略。研究并非简单串联两步反应，而是通过严谨的数学推导（推广了Sih理论的应用），构建了用于过程优化的定量模型。该模型将经典的对映选择性酶促反应的E值与酸水解的立体化学保真度（x参数）统筹考虑，实现了反应进程的可预见性最优控制。
从全细胞催化到可溶性酶提取物的过渡，是本研究的另一重要亮点。通过制备冻干酶粉，实现了催化剂的高活性、高稳定性和均相反应条件，并将底物浓度提升至53 g/L水平，使该过程具备了初步的工业可行性基础。
研究如实报道了B. sulfurescens对底物2水解活性低的负面结果，并由此出发开发替代策略，体现了研究团队面对实验瓶颈时的创造性解决思路。该方法体系本质上是对”缺乏对映互补环氧化物水解酶时如何实现对映体汇聚”这一基础性问题的系统回答。
该研究在生物催化用于手性药物合成领域提供了方法学范例，其科学价值和潜在的工业应用前景均值得关注。