这项研究由来自中国多所顶尖研究机构的团队完成，主要作者包括Zhen-Zhen Lai（复旦大学附属妇产科医院生殖免疫实验室）、Yun Wang（上海交通大学医学院附属第九人民医院辅助生殖科）等14位研究者，通讯作者为复旦大学的Ming-Qing Li教授。研究成果于2022年9月6日发表在Theranostics期刊（2022年第12卷第15期，页码6527-6547），论文标题为《Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure》。

学术背景

研究聚焦于生殖医学领域的关键难题——反复种植失败（Recurrent Implantation Failure, RIF）。尽管辅助生殖技术（ART）已取得重大进展，但约10%接受体外受精（IVF）的女性仍面临RIF问题，其定义为40岁以下女性在至少3个移植周期中未能实现临床妊娠。现有研究表明，子宫内膜容受性（Endometrial Receptivity）障碍是RIF的重要诱因，但关于RIF患者在植入窗口期（Window of Implantation, WOI）的子宫内膜细胞特征及细胞间通讯机制仍不清楚。本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，绘制健康与RIF患者子宫内膜在WOI时期的分子和细胞图谱，揭示其病理机制。

研究流程与方法

1. 样本收集与处理

   • 研究对象：6名RIF患者（年龄32-35岁）和3名健康对照（年龄29-35岁），均在自然周期排卵后第7天（LH+7，即WOI时间）采集子宫内膜组织。
     
   • 单细胞分离：组织经胶原酶IV消化后，通过70 μm和35 μm细胞筛过滤，使用死细胞去除试剂盒富集活细胞（存活率>90%）。
     

2. 单细胞测序与数据分析

   • 文库构建：采用10x Genomics Chromium系统构建单细胞转录组文库，每个样本平均捕获6000个细胞。
     
   • 数据分析：使用Seurat软件（v3.1.4）进行标准化和批次校正，基于PCA降维和t-SNE聚类识别细胞亚群。创新性应用了NovelBrain云平台（https://singlecell.novelbrain.com）进行交互式分析。
     
   • 功能验证：通过免疫荧光、流式细胞术和qRT-PCR验证关键标记基因（如CD63、PGR、MMP14）的表达。
     

3. 实验验证

   • 体外模型：利用原代子宫内膜基质细胞（ESC）和上皮细胞系（HEEC）进行共培养实验，探究外泌体（exosome）对NK细胞的影响。
     
   • 外泌体分析：通过GW4869（外泌体抑制剂）处理HEEC，验证其对NK细胞亚群比例的调控作用。
     

主要发现

1. 子宫内膜成纤维样细胞（Fibroblast-like cells, Fib）的异质性

   • 鉴定出4种Fib亚群：高增殖性FibP、高蛋白合成能力的Fib1、高组织重塑能力的Fib2及分化终末的Fib3。伪时间分析显示，FibP→Fib1→Fib2→Fib3的分化轨迹与月经周期同步。
     
   • RIF相关异常：Fib1和Fib2中子宫内膜容受性相关基因（如IGFBP3、APOD）表达显著降低，且Fib1比例减少，FibP比例增加（图2d, 3f）。
     

2. 上皮细胞（Epithelial cells, EC）亚群的缺陷

   • 发现新型EC1亚群：高表达孕酮受体（PGR）和自噬相关基因（ATG5、MAP1LC3B），具有强外泌体分泌能力。
     
   • RIF特征：EC1比例在RIF患者中显著下降（图5d-e），且其外泌体分泌功能受损，可能影响NK细胞招募（图7a）。
     

3. NK细胞亚群失衡

   • 子宫内膜NK细胞分为4类：组织驻留型NK1、招募型NK2（CD49a+CXCR4+）、糖酵解活跃型NK3和细胞毒性NK4。
     
   • 关键机制：EC1分泌的外泌体和Fib1产生的CXCL12/IL15是维持NK2存活的关键因素。RIF患者中NK2比例降低，NK4比例升高（图6g）。
     

4. 细胞通讯网络紊乱

   • 通过CellPhoneDB分析预测，Fib1-EC1-NK2轴通过CXCL12/CXCR4、IL15/IL15R等配体-受体对维持子宫内膜微环境稳态（图7b, 8a）。RIF中该网络破坏导致免疫调节和血管生成异常。
     

结论与意义

本研究首次在单细胞分辨率下揭示了RIF患者子宫内膜的细胞和分子特征，提出以下创新性结论：
1. 科学价值：
- 明确了Fib1/EC1-NK2轴在子宫内膜容受性中的核心作用，为RIF的病因诊断提供了新靶点（如APOD、CXCL12）。
- 揭示了孕酮-自噬-外泌体通路调控NK细胞募集的机制（图4c-d）。

1. 应用前景：
   
   • 通过scRNA-seq数据可开发子宫内膜容受性评估工具，优化IVF胚胎移植时机。
     
   • 靶向EC1外泌体或Fib1的CXCL12可能成为治疗RIF的新策略。
     

研究亮点

1. 技术创新：

   • 整合scRNA-seq与体外功能验证，首次绘制RIF患者的子宫内膜细胞互作图谱。
     
   • 开发了基于配体-受体对的细胞通讯分析方法（CellPhoneDB）。
     

2. 发现新颖性：

   • 鉴定出EC1这一具有外泌体分泌功能的上皮亚群，并证实其与NK2细胞的调控关系。
     
   • 提出“子宫内膜Fib分化轨迹异常”是RIF的新机制（图3a-d）。
     

其他价值

研究还发现自噬和衰老相关基因在RIF患者中普遍下调，提示子宫内膜细胞功能退化可能是RIF的潜在标志。数据已公开于NCBI GEO（GSE183837），为后续研究提供资源。