本文介绍了一项由乌干达医学研究理事会（MRC）乌干达病毒研究所（UVRI）和伦敦卫生与热带医学院联合研究单位、英国格拉斯哥大学病毒研究中心、乌干达总统府科技与创新秘书处以及英国伦敦国王学院盖伊和圣托马斯国民保健服务基金会信托等多家机构的研究人员共同完成的研究。这项研究以“优化和验证用于乌干达检测和定量抗SARS-CoV-2刺突蛋白、RBD及核蛋白IgG、IgM和IgA抗体的常规ELISA方法及临界值”为题，于2023年3月14日发表在免疫学期刊《Frontiers in Immunology》上。
本研究属于免疫学领域，具体聚焦于B细胞生物学和传染病血清学监测。自2019年底SARS-CoV-2全球大流行以来，准确监测人群抗体反应对于评估人群免疫力、追踪病毒变异株的影响以及指导公共卫生政策（如疫苗接种策略）至关重要。尽管市场上已有多种商业检测试剂盒，但这些试剂盒在不同实验室间存在不一致性，且其临界值可能不适用于所有人群，特别是在撒哈拉以南非洲等地区。这些地区的人群可能因既往接触其他冠状病毒而产生不同程度的交叉反应抗体，导致检测特异性降低。因此，开发一种针对特定人群优化和验证的内部（in-house）酶联免疫吸附试验（ELISA），对于实现准确的血清流行病学调查至关重要。
本研究的主要目标是：针对乌干达及类似环境（撒哈拉以南非洲地区），开发、优化并验证一种内部的间接ELISA方法，用于检测和定量针对SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike, S）、受体结合域（Receptor Binding Domain, RBD）和核蛋白（Nucleoprotein, N）的IgG、IgM和IgA结合抗体。研究特别关注确定区分抗体阳性与阴性的最佳光学密度（Optical Density, OD）临界值，并对该ELISA方法的各项性能参数（如检测限、定量限、准确性、精密度、平行性等）进行全面验证。
本研究包含多个系统性的步骤，主要流程如下：
1. 研究设计与人群样本收集： 研究获得了乌干达病毒研究所伦理委员会和国家科技委员会的批准。研究对象包括两个关键组别： * 阳性对照组： 来自乌干达Masaka和Entebbe隔离医院的PCR确诊SARS-CoV-2感染者。研究者对这部分人群进行了长达24个月的随访，收集急性期和恢复期样本。为了确定临界值，研究选取了每个抗体同种型（IgG、IgM、IgA）在感染后达到初次峰值时的血浆/血清样本作为阳性对照。这些样本主要来自A23.1变异株流行波次，且包含大量无症状（66%）和轻症（15%）感染者，这确保了所建立的方法适用于检测低抗体水平。 * 阴性对照组： 使用2012年至2017年间（即新冠疫情前）收集的存档血清/血浆样本，这些样本被假定为SARS-CoV-2抗体阴性，用于评估背景交叉反应性和确定特异性临界值。
2. 内部ELISA方法的建立与优化： 研究者采用了一种基于Pickering等人方法的间接ELISA。具体流程包括： * 包被： 在96孔板中包被S蛋白、RBD蛋白或N蛋白抗原。 * 封闭： 使用含有牛血清白蛋白（BSA）的缓冲液封闭非特异性结合位点。 * 孵育样本： 加入经热灭活、按1:100稀释的待测血清或血浆样本。 * 孵育检测抗体： 分别使用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、IgM或IgA二抗进行孵育。 * 显色与读数： 加入TMB底物显色，用盐酸终止反应后，在450nm波长下读取OD值。 * 对照设置： 每板均包含预先确定的阴性和阳性血浆对照、针对N蛋白的单克隆抗体CR3009和针对S蛋白的单克隆抗体CR3022作为阳性对照，以及空白对照。 * 抗体定量： 为了定量抗体浓度（ng/ml），研究还建立了一个基于抗人κ和λ轻链捕获抗体的间接捕获ELISA。将商业化的人IgG、IgA和IgM标准品进行系列稀释后与样本一同孵育，通过建立四参数逻辑（4PL）标准曲线，从样本OD值外推其抗体浓度。
3. 临界值确定方法的比较与选择： 为了找到最佳区分阳性与阴性样本的OD临界值，研究者系统比较了五种统计方法： * 均值±2倍标准差（Mean ± 2SD）与均值±3倍标准差（Mean ± 3SD）： 基于阴性对照样本的OD值分布进行计算。 * 空白值4倍法（4-fold above blanks）： 以所有检测板空白孔平均OD值的4倍作为临界值。 * 自助法（Bootstrapping）： 对阴性样本进行重抽样，计算其OD值95%置信区间的上限作为临界值。 * 受试者工作特征曲线分析（Receiver Operating Characteristic, ROC）： 这是本研究的关键分析方法。它同时使用阳性对照（PCR阳性者抗体峰值样本）和阴性对照（疫情前样本）的OD值，通过绘制敏感性（真阳性率）与1-特异性（假阳性率）的关系曲线，寻找最佳临界点。最佳点通常是最接近曲线左上角（0,1）的点，即同时最大化敏感性和特异性。
4. ELISA方法性能参数的全面验证： 为确保方法的可靠性与可重复性，研究进行了多项验证： * 检测限与定量限： 通过系列稀释阳性样本或商业化标准品，分别确定了基于直接抗原捕获和间接κ/λ轻链捕获两种方式的“检测限”（Limit of Detection, LoD）和“定量限”（Limit of Quantitation, LoQ）。 * 准确性验证： 使用世界卫生组织（WHO）提供的SARS-CoV-2 IgG血清学验证盘（20/B770-02，包含23个已知阳性和14个已知阴性样本）来评估该ELISA的敏感性和特异性。 * 国际标准校准： 使用WHO第一个抗SARS-CoV-2抗体国际标准品（20/136）将内部测定的抗体浓度（ng/ml）校准为国际通用的结合抗体单位（Binding Antibody Units, BAU/ml），以确保结果在国际间的可比性。 * 平行性： 比较同一捐赠者血清和血浆样本的检测结果，评估两种样本类型的一致性。 * 精密度： 评估了板内、板间（不同日期）以及不同操作者之间的变异系数（Coefficient of Variation, CV），要求CV ≤ 25%。 * 线性： 评估标准曲线在定量范围内的线性关系。 * 室间验证： 将相同的样本分别在乌干达病毒研究所和英国帝国理工学院实验室进行检测，以评估方法在不同实验室间的可重复性。 * 持续质控： 使用WHO标准品和内部自制对照品绘制Levy-Jennings质控图，监测检测过程的长期稳定性。
5. 数据分析： 使用R语言（4.1版）、Stata 15和GraphPad Prism（9.40版）进行统计分析和图表绘制。采用描述性统计、Spearman秩相关检验、线性回归模型和ROC曲线分析等方法处理数据。
1. ROC分析法被确定为计算临界值的最佳方法： 对比五种方法后发现，均值±2SD/3SD法虽然特异性高，但敏感性显著较低，导致大量PCR阳性样本被错误判定为阴性（假阴性率高）。自助法和4倍空白值法敏感性好，但特异性不如ROC法。ROC曲线分析在优先保证高特异性的同时，实现了最高的敏感性，并且其曲线下面积（AUC）最接近1，表明分类性能最优。因此，研究最终采纳了ROC法确定的临界值。
2. 针对不同抗原和抗体同种型的具体临界值： 通过ROC分析，研究确定了在乌干达人群中区分阳性和阴性的OD临界值。例如： * 抗刺突蛋白（S）抗体：IgG临界值为0.432，IgM为0.459，IgA为0.226。 * 抗核蛋白（N）抗体：IgG临界值为0.454，IgM为0.229，IgA为0.225。 * 抗RBD抗体：IgG临界值为0.178，IgM为0.297，IgA为0.107。
3. ELISA方法验证结果优异： * 准确性： 使用WHO验证盘（20/B770-02）验证，本方法对S-IgG的检测敏感性和特异性均达到100%，与WHO参考标准完全一致。 * 平行性： 血清和血浆样本的OD值高度相关（r = 0.93, p < 0.0001），表明两种样本类型可互换使用。 * 精密度： 板间、板内及操作者间的变异系数中位数为12.2%，远低于25%的接受标准，表明方法重复性好。 * 国际标准校准： 成功建立了将ng/ml浓度转换为BAU/ml的线性模型，所有抗体同种型的校准模型线性良好（R² > 0.99）。 * 检测限与临床相关性： 确定的S-IgG阴性临界值对应的抗体浓度中位数为1.49 BAU/ml，RBD-IgG为2.40 BAU/ml，这些值与WHO定义的低滴度范围一致，说明该方法能有效检测出低水平抗体反应。 * 室间一致性： 乌干达和英国两个独立实验室对相同样本的检测结果高度一致，证明了方法的稳健性和可转移性。
4. 发现N-IgM检测性能的局限性： 一个重要的发现是，无论采用哪种临界值计算方法，针对N蛋白的IgM检测都表现出较低的敏感性和特异性（AUC < 0.5）。这表明，在乌干达人群中，仅凭N-IgM单项检测不足以可靠诊断SARS-CoV-2感染，尤其是在感染早期或抗体水平较低时。研究者建议，N-IgM检测应与其他方法（如病毒RNA或抗原检测）结合使用，以提高诊断准确性。
本研究成功开发并全面验证了一种适用于乌干达及类似撒哈拉以南非洲环境的内部ELISA方法，用于检测和定量SARS-CoV-2 S、RBD和N蛋白特异性的IgG、IgM和IgA抗体。
科学价值与应用价值： * 提供人群特异性工具： 该方法充分考虑了当地人群可能存在的背景抗体交叉反应性以及以无症状/轻症感染为主的流行病学特征，所确定的临界值更具针对性和准确性，避免了使用基于重症患者开发的商业试剂盒可能导致的假阴性问题。 * 支持血清学监测： 该高性价比、可靠的ELISA为在资源有限地区开展大规模人群血清流行病学调查、评估疫苗免疫原性、追踪免疫持久性以及监测新变异株的免疫逃逸潜力提供了关键工具。 * 促进国际可比性： 通过校准到WHO国际标准单位（BAU/ml），使得本研究的数据能够与全球其他研究进行直接比较。 * 指导诊断策略： 研究明确指出N-IgM单项检测的局限性，为当地和类似地区的实验室诊断策略提供了重要参考。
研究者在讨论中也指出了本研究的局限性及未来方向： * 病毒变异的影响： 研究所用抗原为武汉原型株，而流行毒株已发生多次变异（如奥密克戎）。虽然A23.1变异株的突变相对较少，但针对未来可能出现的高度突变株，本方法的检测性能可能需要重新评估。 * 对照品的需求： 目前WHO标准主要针对S-IgG，缺乏其他抗原（如N蛋白）和其他抗体同种型（如IgM、IgA）的明确阳性国际对照品，这对全球范围内标准化相关检测构成了挑战。 * 持续优化的必要性： 随着疫情演变和科学认知的深入，此类检测方法需要持续优化和验证，以适应不断变化的流行病学格局和公共卫生需求。
这项研究为在撒哈拉以南非洲等特定环境下进行高质量的SARS-CoV-2抗体监测提供了经过严格验证的、可靠的方法学基础和具体参数，对于全球应对新冠疫情，特别是在资源有限地区的科学防控具有重要的实践意义。