骨髓微环境的分子、细胞与空间转录组解析——单细胞与空间转录组技术的结合研究

作者与机构
本研究由Chiara Baccin（欧洲分子生物学实验室EMBL与海德堡大学联合培养）、Jude Al-Sabah（海德堡干细胞技术与实验医学研究所HI-STEM）、Lars Velten（EMBL）等共同主导，合作单位包括德国癌症研究中心（DKFZ）、苏黎世大学医院等。论文于2019年7月预印于*bioRxiv*，采用CC-BY-NC 4.0许可。

学术背景
骨髓（bone marrow, BM）是造血和骨骼再生的核心场所，但其细胞组成与空间 niche（微环境）的异质性长期存在争议。传统研究依赖单一标记基因或遗传学手段定位 niche 细胞，无法全面解析细胞互作网络（如CXCL12或SCF等关键细胞因子的来源）。为此，研究团队整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与空间转录组技术（spatial transcriptomics），旨在系统性绘制骨髓微环境的分子-细胞-空间三维图谱，揭示 niche 因子的时空分布规律。

研究流程与创新方法

1. 单细胞转录组测序与细胞分型

   • 样本策略：通过流式分选逐步富集稀有小鼠骨髓细胞（如非造血细胞），覆盖总BM、酶消化骨组织等5类样本（共7497个细胞），检测中位基因数1999个/细胞。
     
   • 数据分析：
     
     • 聚类识别32种细胞类型，包括造血细胞（HSPCs、B/T细胞谱系）、间充质细胞（如CXCL12富集的网状CAR细胞亚群、成骨细胞）、血管细胞（动脉/窦状内皮细胞）等。
       
     • 基于标志基因（如CD45、LepR、Emcn）、基因本体（GO）和CIBERSORT算法验证分型准确性。
       
     • 创新工具：提出RNA速率（RNA-velocity）伪时间分析，揭示NG2+间充质干细胞（MSCs）处于分化顶端，下游为成骨细胞、CAR细胞等。
       

2. 空间转录组定位

   • LCM-seq技术优化：开发基于随机引物的激光捕获显微切割测序（LCM-seq），适配固定骨髓切片（78个区域），按血管类型（动脉/窦状）或骨内膜距离分层采样。
     
   • 空间注释：
     
     • CIBERSORT算法将scRNA-seq数据映射至空间区域，验证osteoblast（成骨细胞）富集于骨内膜，而新发现的Adipo-CAR（表达LepR）和Osteo-CAR（表达Osterix）分别定位于窦状和动脉周niche。
       
     • 免疫荧光验证：CXCL12-GFP小鼠中，Adipo-CAR（CXCL12+ALPL−）包裹窦状血管，Osteo-CAR（CXCL12+ALPL+）延伸至动脉周围。
       

3. RNA-Magnet算法预测空间互作

   • 原理：基于细胞黏附分子（如Cadherins、Integrins）的表达量化细胞间吸引力，以前述四种锚定细胞（成骨细胞、动脉内皮等）为参照。
     
   • 结果：预测与实验定位高度一致（如平滑肌细胞优先黏附动脉内皮），揭示血管周niche的层级结构（血管内膜-中膜-外膜）。
     

4. 细胞因子来源与niche功能

   • 核心发现：CAR细胞是CXCL12、SCF、IL-7等因子的主要来源，其转录组中细胞因子相关基因占比显著高于其他细胞（如内皮细胞）。
     
   • 空间模式：窦状niche高表达CXCL12，动脉niche富集Kitl，非血管区域因子水平最低，提示血管支架主导细胞因子分泌。
     

主要结果与逻辑链条
1. 新型CAR细胞亚群的发现：Adipo-CAR与Osteo-CAR的转录差异（如LepR vs. Sp7）和空间分离，解决了既往关于“CAR细胞异质性”的争议（Greenbaum et al., 2013）。
2. niche组织的预测模型：RNA-Magnet首次证明细胞黏附分子足以预测复杂组织的空间排布，为器官建模提供新工具。
3. 专业分泌细胞的定义：CAR细胞的“高细胞因子输出”特性（占转录组10%）提示其作为niche中枢的功能，补充了Ding et al. (2012)的血管周niche理论。

结论与价值
1. 科学意义：
- 提出“血管支架定位专业分泌细胞”的niche组装模型，调和了“动脉vs.窦状niche重要性”的争议（Morrison & Scadden, 2014）。
- 首次系统性解析骨髓的全细胞图谱和空间互作网络，为造血调控研究提供基准数据集（可交互访问：http://nicheview.shiny.embl.de）。
2. 技术贡献：LCM-seq的固定组织兼容性、RNA-Magnet的开源算法（纳入CellAdhesionDB数据库），为其他器官研究提供范式。

研究亮点
1. 方法整合：首次耦合单细胞与空间转录组，弥补单细胞技术丢失空间信息的缺陷。
2. 理论突破：发现Osteo-CAR（既往未被识别）及其动脉niche倾向性，挑战了“CXCL12仅由窦状niche分泌”的认知。
3. 跨学科价值：RNA-Magnet可推广至肿瘤微环境或发育生物学研究。

其他价值
- 数据公开性：完整代码与数据集共享，助力社区对髓系疾病（如骨髓纤维化）的机制挖掘。
- 争议回应：证实NG2+ MSCs的干细胞属性（表达CD200/CD51），澄清了Méndez-Ferrer et al. (2010)的争议结论。

（注：此为精简框架，详细数据可参考原文图3-7及附表S1-S3。）