线粒体膜电位作为逆行信号调控细胞周期进程

主要作者与研究机构

该研究由Choco Michael Gorospe、Gustavo Carvalho、Alicia Herrera Curbelo、Lisa Marchhart、Isabela C Mendes、Katarzyna Niedźwiecka及Paulina H Wanrooij等人完成。研究团队主要来自瑞典于默奥大学（Umeå University）医学生物化学与生物物理学系，其中Katarzyna Niedźwiecka同时隶属于波兰科学院生物化学与生物物理学研究所。通讯作者为Paulina H Wanrooij。该论文发表于Life Science Alliance期刊，2023年9月11日在线发表，DOI为10.26508/lsa.202302091。

研究背景

线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，不仅通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）产生细胞所需的大部分ATP，还参与铁硫簇合成、氨基酸与核苷酸生物合成、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生以及细胞凋亡等多种重要生理过程。线粒体功能障碍与神经退行性疾病、代谢综合征、癌症和衰老等多种疾病密切相关。为了避免或减轻线粒体功能障碍带来的严重后果，细胞演化出了一套复杂的线粒体-细胞通讯机制，即线粒体逆行信号（mito-cellular signalling），将线粒体的功能状态传递给细胞核及其他细胞器，从而启动适应性反应或消除受损线粒体。

线粒体拥有自己的基因组——线粒体DNA（mtDNA），编码电子传递链（electron transport chain, ETC）复合物的关键亚基以及ATP合酶的Fo组分。失去mtDNA的细胞被称为ρ0细胞（ρ0 cells），它们无法通过质子泵维持线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ΔΨm），只能依靠F1-ATPase“反向”水解ATP以及腺嘌呤核苷酸转运体（adenine nucleotide translocator）的电致交换来维持有限的ΔΨm。已有研究表明，ρ0酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞表现出G1期细胞积累的细胞周期缺陷，具体表现为G1期到S期的过渡延迟。然而，这种细胞周期阻滞的初始触发信号一直未被彻底阐明。此前研究曾提出铁硫簇代谢缺陷、ROS升高或ATP合成不足等假说，但均未得到明确证实。本研究的核心目标是鉴定ρ0细胞G1-to-S过渡延迟的近端信号分子，即线粒体功能障碍启动细胞周期调控的最初信号。

研究流程与实验设计

研究团队首先构建了ρ0酵母菌株，即通过溴化乙锭（ethidium bromide）标准处理方法使野生型（wild-type, wt）ρ+菌株失去mtDNA，并通过定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）确认mtDNA的完全丢失。此外，研究还利用已知mtDNA维持因子缺陷菌株（rim1Δ、mip1Δ、mgm101Δ）作为独立验证，证明这些菌株同样表现出G1期细胞比例升高的表型。

在细胞周期分析方面，研究采用流式细胞术（flow cytometry）检测DNA含量，利用Multicycle模型在FCS Express软件中对G1、S和G2期细胞比例进行定量。对于同步化实验，研究使用α因子（α-factor）处理使细胞同步于G1期，或使用诺考达唑（nocodazole）处理使细胞同步于G2期，随后释放并每隔10分钟采样，观察细胞周期进程的动态变化。

为探究ΔΨm在细胞周期调控中的作用，研究采用了多种药理学和遗传学干预手段。使用寡霉素（oligomycin）抑制线粒体ATP合酶以阻断线粒体ATP合成；使用解偶联剂BAM15或CCCP消散ΔΨm；使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）或还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）降低ROS水平。ΔΨm的测量采用荧光阳离子染料四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate, TMRE），并用非基吖啶橙（nonyl acridine orange, NAO）染色校正线粒体质量差异，最终通过流式细胞仪定量。氧化应激水平则通过脂质过氧化测定（硫代巴比妥酸反应物法）和MitoSOX Red荧光检测线粒体超氧化物来评估。

遗传学干预方面，研究引入了atp1-111突变。该突变位于线粒体F1-ATPase的Atp1亚基，导致酶活性增强，从而在ρ0细胞中产生比野生型ρ0细胞更高的ΔΨm。此外，研究还构建了缺失核编码细胞色素c氧化酶亚基Cox4的菌株（cox4Δ），该菌株保留mtDNA但ETC功能受损，用于区分ΔΨm维持能力与ETC功能对细胞周期的影响。

基因表达分析通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）进行。细胞从α因子同步化释放后，每隔10分钟取样提取RNA，检测G1细胞周期蛋白基因CLN1、CLN2、CLN3、CLB5、CLB6以及转录抑制因子WHI5的表达动态，以ACT1作为内参基因，采用Pfaffl方法计算相对表达量。细胞大小测定则通过锥虫蓝染色后显微镜成像，利用Fiji软件测量未出芽（即G1期）细胞的横截面积。

主要研究结果

研究首先确认了ρ0细胞G1-to-S过渡延迟的表型。在非同步化培养中，ρ0细胞的G1期比例是ρ+细胞的两倍。α因子同步化释放实验显示，ρ0细胞进入S期的时间明显晚于ρ+细胞；从G2同步化释放后，ρ0细胞虽然G2退出时间与ρ+相当，但随后在G1期积累并延迟进入S期。这一结果证实了ρ0细胞的细胞周期缺陷特异性地定位于G1-to-S过渡。

在排除线粒体ATP合成不足作为信号的研究中，用寡霉素处理ρ+细胞并未导致G1期细胞积累，尽管寡霉素确实影响了ΔΨm。这表明线粒体ATP合成的抑制本身并不足以触发G1-to-S延迟。

关键发现来自ΔΨm的干预实验。用BAM15处理ρ+细胞后，细胞出现短暂的G1期积累，伴随S期细胞比例下降，CCCP处理也产生类似效果。在α因子同步化后释放到含BAM15培养基的实验中，ρ+细胞G1退出时间从正常培养基中的20分钟延迟到70分钟，证明ΔΨm的消散足以诱导G1-to-S过渡延迟。此外，ρ0细胞本身维持着虽然低于ρ+但仍高于背景的ΔΨm，而用BAM15进一步消散ρ0细胞的ΔΨm后，其G1期积累更加明显且更为持久。这建立了ΔΨm降低程度与G1-to-S延迟程度之间的定量相关性。

逆转实验进一步证实了ΔΨm的因果作用。atp1-111 ρ0细胞的ΔΨm恢复到了与ρ+细胞相当的水平，其非同步化培养的细胞周期谱与野生型ρ+细胞无显著差异。α因子同步化释放实验中，atp1-111 ρ0细胞在释放后30分钟时G1期细胞比例仅为67%，而野生型ρ0和cox4Δ ρ0细胞仍高于90%。同时，atp1-111 ρ0细胞的菌落大小和液体培养基中的生长速率也部分恢复。这些结果表明，提高ΔΨm足以挽救ρ0细胞的细胞周期缺陷。

在氧化应激方面，H2O2处理ρ+细胞主要导致S期早期积累，而非G1期积累。抗氧化剂NAC或GSH处理虽然导致G1期细胞短暂积累，但进一步测量发现这些抗氧化剂显著降低了ΔΨm，其效果与解偶联剂相当。因此，抗氧化剂对细胞周期的影响可能是通过降低ΔΨm间接实现的，而非通过降低ROS水平本身。此外，所有测试菌株（wt、atp1-111、cox4Δ的ρ+和ρ0变体）之间的脂质过氧化水平和线粒体超氧化物水平均无显著差异。这些结果表明氧化应激水平与G1-to-S延迟并无直接关联。

在机制探索方面，研究考察了细胞大小和G1/S转录程序的时序。显微镜测量显示，wt和cox4Δ ρ0细胞的G1期细胞面积小于其相应的ρ+细胞，而atp1-111 ρ0细胞的细胞大小与atp1-111 ρ+及wt ρ+细胞相当。根据START检查点的细胞大小阈值模型，更大的细胞尺寸意味着更短的pre-START G1期，这可能是atp1-111 ρ0细胞细胞周期表型恢复的原因。然而，RT-qPCR分析显示，atp1-111 ρ0细胞中CLN1和CLN2的转录诱导仍然延迟，与wt ρ0细胞相似，并未因ΔΨm恢复而提前。这表明atp1-111 ρ0细胞中细胞周期表型的恢复并非通过提前启动G1/S转录实现，而是涉及G1和S细胞周期蛋白转录下游的调控步骤。其他可能参与的通路包括蛋白激酶A（PKA）、TOR或Snf1/AMPK信号通路，以及作用于Cln1/2-Cdk1复合物的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，这些有待未来研究进一步阐明。

研究结论与意义

本研究明确鉴定出线粒体膜电位（ΔΨm）是调控酿酒酵母细胞周期G1-to-S过渡的关键逆行信号。在ρ0细胞中，ΔΨm的降低引发G1-to-S过渡延迟；通过atp1-111突变提高ΔΨm能够挽救这一缺陷。ΔΨm的调控作用不仅限于ρ0细胞——在含mtDNA的ρ+细胞中消散ΔΨm同样能够诱导G1-to-S延迟。线粒体ATP合成不足和氧化应激水平变化均不能解释ρ0细胞的细胞周期表型。这些发现确立了ΔΨm作为线粒体功能状态向细胞周期机制传递信号的核心角色。

在机制层面，atp1-111 ρ0细胞的细胞周期表型恢复可部分归因于其较大的细胞尺寸——较大的细胞达到START检查点所需的临界细胞大小所需时间更短。然而，G1/S转录时序并未恢复，表明还存在下游调控环节的改善。这一发现为理解线粒体功能障碍如何影响细胞增殖提供了新的视角，也为线粒体疾病的病理机制提供了潜在解释。在线粒体疾病中，ETC或ATP合酶功能缺陷通常伴随ΔΨm降低，而细胞周期进程的抑制可能构成疾病症状的一部分。未来若能鉴定介导ΔΨm信号传递至细胞周期机制的具体分子，可能为治疗线粒体疾病提供新的靶点。

研究亮点

本研究的亮点之一在于系统性地排除和验证了多种候选信号，最终将ΔΨm确立为细胞周期调控的逆行信号。研究采用了遗传学与药理学相结合的策略，利用atp1-111突变在ρ0背景下恢复ΔΨm，构成了有力的因果验证。此外，研究明确指出氧化应激和ATP合成不足并非该细胞周期延迟的原因，纠正了此前领域内的普遍假设。该研究还揭示了细胞大小与ΔΨm之间的功能关联，为理解线粒体状态如何整合到细胞生长与分裂的协调机制中提供了新的思路。在方法学上，研究结合了流式细胞术、同步化释放实验、ΔΨm与线粒体质量的双重荧光校正以及RT-qPCR转录时序分析，形成了多层次的证据链条，增强了结论的可靠性。