基于骨基质启发的羟基磷灰石杂化生物墨水构建大型自矿化骨类器官的工程研究

作者及单位
本研究的通讯作者为Jian Wang、Yan Wu、Guangfeng Li等，来自上海大学转化医学研究院肌肉骨骼类器官研究中心（Institute of Translational Medicine, Musculoskeletal Organoid Research Center, Shanghai University）。合作单位包括上海交通大学医学院附属新华医院骨科、西安交通大学附属红会医院骨科等。研究成果发表于Advanced Materials期刊（2024年，卷36，文章编号2309875）。

学术背景

研究领域与动机
骨缺损修复是组织工程领域的重大挑战，尤其是临界尺寸骨缺损（critical-sized bone defects）因自我修复能力有限，常导致愈合延迟或骨不连（nonunion）。现有临床解决方案（如金属植入物、同种异体移植物）存在供体限制、疾病传播风险和骨整合不良等问题。干细胞衍生的类器官（organoids）为骨再生提供了新思路，但骨类器官的开发面临独特挑战：需兼具机械支撑功能和模拟骨细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的无机/有机杂化特性。

关键科学问题
1. 机械支撑需求：骨组织需承受力学载荷，而传统软材料类器官（如凝胶基质）力学强度不足。
2. ECM仿生设计：天然骨ECM含60%无机羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP）和40%有机成分（如胶原蛋白），需开发兼具矿化能力和细胞相容性的生物墨水（bioink）。
3. 规模化构建：现有骨类器官多为微米级，难以满足大尺寸骨缺损修复需求。

研究目标
开发一种基于明胶甲基丙烯酰胺/海藻酸甲基丙烯酰胺/羟基磷灰石（GelMA/AlgMA/HAP）的杂化生物墨水，通过数字光处理（digital light processing, DLP）生物打印技术构建大型骨类器官，实现长期培养、自矿化和多细胞分化。

研究方法与流程

1. 生物墨水设计与表征

材料制备
- GelMA/AlgMA/HAP生物墨水：将光交联的GelMA（模拟胶原蛋白）、AlgMA（提供离子交联位点）与纳米HAP混合，形成无机/有机杂化体系。
- 对照组：纯GelMA、GelMA/AlgMA。

性能测试
- 机械性能：压缩模量测试显示，GelMA/AlgMA/HAP的压缩强度（170 kPa）比纯GelMA（50 kPa）提高340%。
- 矿化能力：扫描电镜（SEM）和能谱分析（EDS）证实HAP组存在钙（Ca）/磷（P）元素分布，而对照组无矿化信号。
- 降解动力学：体外28天降解实验表明，HAP延缓降解速率（残留质量12%），而纯GelMA几乎完全降解。

2. 3D生物打印与细胞培养

打印工艺
- DLP生物打印：采用高精度DLP技术打印复杂结构（如多孔圆柱体、兔形模型），最小孔径达50 μm。
- 细胞封装：将骨髓间充质干细胞（BMSCs）嵌入生物墨水，打印后长期培养（14天）。

细胞行为分析
- 存活率：活/死染色显示所有组别细胞存活率>90%，HAP组细胞迁移至支架表面并形成3D网络。
- 增殖能力：CCK-8检测证实HAP组细胞增殖速率显著高于对照组。

3. 体外矿化与分化评估

实验设计
- 矿化监测：通过微型CT（μCT）动态观察40天培养期间的矿化过程。
- 分化标志物检测：碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红（ARS）染色、RT-qPCR（检测Runx2、OCN等基因）、Western blot（检测BMP-2、OCN等蛋白）。

结果
- 矿化体积：HAP组在40天时矿化体积（TMV）为对照组的6倍，矿化密度（OMD）接近天然松质骨。
- 成骨分化：HAP组的ALP活性提高2倍，ARS钙结节数量增加9倍，Runx2和OCN基因表达上调。

4. 体内类器官形成与修复验证

动物模型
- 皮下植入：将生物打印支架植入裸鼠皮下，20/40天后评估。
- 颅骨缺损模型：在大鼠5 mm临界尺寸颅骨缺损中植入支架，8周后评估修复效果。

关键发现
- 血管化与多细胞分化：免疫荧光显示HAP组形成CD31+血管网络，并出现脂肪细胞（Perilipin+）、软骨细胞（Collagen II+）和破骨细胞（TRAP+）。
- 力学性能：纳米压痕测试表明，40天培养后HAP组杨氏模量（0.414 GPa）接近大鼠松质骨（0.652 GPa）。
- 缺损修复：μCT显示HAP组新骨体积（BV/TV）达61.59%，显著高于对照组。

主要结果与结论

创新性成果

1. 首例大型骨类器官：通过DLP生物打印构建厘米级骨类器官，突破传统微米级限制。
   
2. 自矿化生物墨水：HAP的引入使支架具备持续释放Ca²⁺/PO₄³⁻的能力，促进BMSCs成骨分化。
   
3. 多细胞微环境：类器官内同时存在成骨细胞、血管内皮细胞和脂肪细胞，模拟天然骨 marrow niche。
   

机制解析

转录组测序（RNA-seq）揭示HAP通过激活PI3K/AKT和钙信号通路促进成骨分化。关键基因（如FGF23、Runx2）表达上调，ECM受体相互作用通路显著富集。

应用价值

• 疾病模型：为骨质疏松、骨肿瘤等疾病提供体外研究平台。
  
• 个性化治疗：结合患者来源的BMSCs，可定制化打印骨移植物。
  
• 药物筛选：用于测试促骨再生药物的有效性。
  

研究亮点

1. 仿生设计：GelMA/AlgMA/HAP生物墨水精准模拟骨ECM的有机/无机组成。
   
2. 技术整合：DLP生物打印实现高精度、大规模构建，结合组织透明化技术实现3D血管网络可视化。
   
3. 跨尺度力学匹配：从kPa级水凝胶到GPa级类器官，力学性能动态演化匹配天然骨。
   

局限性：体内血管化仍需依赖宿主微环境，未来需开发体外预血管化策略。

（全文约2000字）