关于HLA I/II双敲除人诱导多能干细胞作为通用型细胞治疗供体来源的研究报告
本研究由美国阿拉巴马大学伯明翰分校生物医学工程、生物化学与分子遗传学、微生物学以及医学/风湿病学等多个院系的研究人员共同完成。主要作者包括Saidulu Mattapally、Kevin M. Pawlik、Vladimir G. Fast、Esther Zumaquero、Frances E. Lund、Troy D. Randall、Tim M. Townes和Jianyi Zhang（通讯作者）。该研究成果以“Human Leukocyte Antigen Class I and II Knockout Human Induced Pluripotent Stem Cell–Derived Cells: Universal Donor for Cell Therapy”为题，于2018年发表在*Journal of the American Heart Association*期刊上。
一、 学术背景与研究目标
本研究属于再生医学与干细胞治疗领域，具体聚焦于利用基因编辑技术解决细胞移植中的免疫排斥问题。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）因其具有分化为各种细胞类型的潜能，被认为是心肌再生等疗法极具前景的细胞来源。然而，无论是使用异体（同种异体）还是自体hiPSCs衍生的细胞进行移植，都面临着免疫排斥的挑战。异体细胞会因主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC，在人类中称为人类白细胞抗原，Human Leukocyte Antigen, HLA）不匹配而被宿主免疫系统识别并攻击。虽然理论上自体移植可以避免此问题，但自体hiPSCs的制备过程耗时过长，无法用于治疗急性疾病，且既往研究甚至发现，即使是在遗传背景完全相同的小鼠模型中，移植由小鼠iPSCs形成的肿瘤仍可能被免疫排斥，这提示了次要抗原或异常抗原表达带来的风险。
因此，开发一种“通用型供体”（universal donor）的hiPSCs细胞系，使其衍生的细胞产品能够适用于所有患者，无需配型且不引发免疫排斥，具有重大的临床意义。先前的研究表明，单独敲除HLA I类分子表达所必需的β2微球蛋白（β2 microglobulin, B2M）虽然能逃逸T细胞识别，却可能使细胞更容易被自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞通过“缺失自我”（missing self）反应清除。此外，人内皮细胞可通过表达MHC II类分子激活同种异体反应性记忆CD4+ T细胞。因此，本研究旨在通过同时敲除HLA I类和II类分子的关键组件，来全面降低hiPSCs及其衍生细胞的免疫原性。
具体而言，研究团队的目标是：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在hiPSCs中同时敲除B2M基因和II类MHC反式激活因子（Class II MHC Transactivator, CIITA）基因，从而产生HLA I/II双敲除（HLA I/II knockout）的hiPSCs。他们计划验证这些基因编辑是否会影响hiPSCs的多能性和分化能力，特别是将其分化为心肌细胞后，评估这些心肌细胞的功能（电生理特性）是否正常，并最关键的是，在体外实验中系统评估它们激活人类免疫细胞（特别是T细胞）的能力是否显著降低。
二、 详细研究流程与方法
本研究包含一系列逻辑严密的实验步骤，从细胞系的构建、表征到功能与免疫学验证。
1. HLA I/II双敲除hiPSCs细胞系的构建与验证： * 研究对象： 起始材料为通过仙台病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc转录因子导入男性人心肌成纤维细胞而生成的hiPSCs（GRiPS）。 * 基因编辑： 使用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除。针对B2M基因设计了两个向导RNA（sgRNA），分别靶向其起始密码子附近的区域；针对CIITA基因设计了三个sgRNA。将这些sgRNA克隆到lentiviral CRISPR/Cas9载体（plentiCRISPR v2）中，包装成慢病毒后转导hiPSCs。转导后的细胞用嘌呤霉素筛选，挑取单克隆进行扩增。 * 敲除验证： 通过桑格测序和蛋白质印迹法（Western blot）在DNA和蛋白水平验证B2M和CIITA的成功敲除。实验获得了仅敲除B2M、仅敲除CIITA以及双敲除的多种克隆。本研究主要使用双敲除克隆进行后续实验。
2. 多能性、分化能力及衍生心肌细胞功能评估： * 多能性评估： 比较野生型（Wild-Type, WT）和HLA I/II敲除hiPSCs的多能性基因（如OCT4, NANOG, TRA-1-60, SSEA4）表达以及端粒酶活性（持续培养超过50代），以确保基因编辑未损害干细胞的基本特性。 * 心肌细胞分化： 使用已建立的定向分化方案，将WT和HLA I/II敲除hiPSCs分化为心肌细胞。通过免疫荧光染色检测心肌细胞标志物，如心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T）、心室肌球蛋白轻链2（MLC2v）、连接蛋白43（Connexin 43）等，以确认分化成功和细胞类型。 * 三维培养与电生理功能分析： 将分化的心肌细胞培养成三维球体（spheroid），并将两个球体融合形成更大的组织样结构（spheroid fusion）。这是本研究评估细胞功能的关键模型。 * 结构分析： 使用透射电子显微镜观察融合球体的超微结构，检查肌节、Z线等心肌特征结构是否正常。 * 电生理光学标测： 这是一种先进的、空间分辨率高的功能评估方法。研究团队使用对钙离子敏感的低亲和力染料（Cal-520FF）和对跨膜电位敏感的染料（RH-237）对球体进行双染色。在施加电刺激后，使用光电二极管阵列记录动作电位和钙瞬变在整个球体上的传播过程。通过分析等时图，计算传导速度；通过分析信号曲线，测量动作电位时程（APD50，即动作电位恢复至50%振幅所需时间）、钙瞬变时程（CaTD50）以及钙瞬变上升时间。这些参数是评估心肌细胞电耦合和收缩功能协调性的核心指标。
3. 免疫原性评估： * T细胞激活实验： 这是评估免疫原性的直接实验。将WT或HLA I/II敲除hiPSCs来源的心肌细胞（以单层形式）与来自健康供体的人外周血单个核细胞共培养。共培养后，收集PBMCs，通过流式细胞术检测T细胞（CD3+）的激活状态，关键激活标志物为CD69。实验设置了阴性对照（仅PBMCs）和阳性对照（PBMCs + PMA，一种强T细胞激活剂）。通过比较CD3+CD69+细胞的比例，量化不同来源心肌细胞激活T细胞的能力。 * 免疫细胞共培养攻击实验： 将WT或HLA I/II敲除hiPSCs来源的心肌细胞球体与PBMCs、或纯化的CD8+ T细胞、或纯化的CD4+ T细胞共培养3-5天。通过显微镜观察并记录球体的大小变化和收缩节律的力度的变化，直观评估免疫细胞对心肌球体的破坏作用。 * HLA非经典分子表达分析： 为了探究双敲除细胞如何应对NK细胞的潜在攻击，研究团队通过蛋白质印迹法检测了在干扰素-γ刺激下，HLA I/II敲除心肌细胞中非经典HLA I类分子HLA-E、HLA-F和HLA-G的表达情况。这些分子，特别是HLA-G，已知可以抑制NK细胞的杀伤活性。
三、 主要研究结果
1. 成功构建并验证了HLA I/II双敲除hiPSCs： 测序和蛋白质印迹结果证实，成功获得了B2M和CIITA基因均发生移码突变并提前终止翻译的hiPSCs克隆。重要的是，这些双敲除细胞与WT hiPSCs在多能性基因表达和端粒酶活性上无显著差异，表明基因编辑未影响其干细胞的本质属性和长期增殖能力。
2. HLA I/II敲除不影响心肌细胞的分化和基本电生理功能： WT和敲除hiPSCs都能高效分化为自发搏动的心肌细胞，并表达典型的心肌标志物。透射电镜显示，敲除细胞形成的球体具有清晰的肌节和Z线结构，与WT无异。最关键的发现来自光学标测：WT和HLA I/II敲除心肌细胞融合球体在传导速度、动作电位时程（APD50）、钙瞬变时程（CaTD50）和钙瞬变上升时间等所有测量的电生理参数上均无统计学差异。这表明，敲除HLA I/II分子并未损害心肌细胞之间的电耦合和正常的兴奋-收缩耦联功能，这对于其治疗心律失常等心脏疾病至关重要。
3. HLA I/II敲除显著降低了hiPSCs衍生细胞的免疫原性： * T细胞激活大幅减弱： 流式细胞术结果显示，与WT hiPSCs来源的心肌细胞共培养后，约75%的T细胞被激活（CD69阳性）。然而，与HLA I/II敲除hiPSCs来源的心肌细胞共培养后，T细胞的激活率（约24%）与阴性对照组（约21%）几乎无差别，且显著低于WT组。这直接证明，敲除B2M和CIITA能几乎完全阻断hiPSCs衍生细胞对同种异体T细胞的激活。 * 免疫细胞攻击耐受性增强： 在球体与免疫细胞共培养实验中，WT心肌球体在与PBMCs、CD8+ T细胞或CD4+ T细胞共培养3-5天后，体积显著缩小，收缩变得无力且不规则。相比之下，HLA I/II敲除心肌球体在相同条件下大小和收缩力度均保持良好，显示出更强的耐受性。 * HLA-G表达维持可能提供NK细胞保护： 蛋白质印迹分析发现，在干扰素-γ刺激下，HLA I/II敲除心肌细胞中HLA-E和HLA-F的表达被抑制，这与CIITA是这两个基因转录激活关键因子的已知功能一致。然而，HLA-G的表达并未被抑制。HLA-G是已知的NK细胞抑制性配体，在胎盘中保护胎儿滋养层细胞免受母体NK细胞攻击。这一结果提示，HLA I/II敲除细胞可能通过保留HLA-G的表达，获得一定的抵抗NK细胞“缺失自我”杀伤的能力。
四、 研究结论与意义
本研究得出结论：利用CRISPR/Cas9技术同时敲除B2M和CIITA，可以成功创建HLA I/II双敲除的hiPSCs。这些细胞能正常分化为功能完整的心肌细胞，并且其衍生的细胞在体外几乎不激活人类T细胞，对免疫细胞的攻击表现出更强的抵抗力。因此，它们有望成为用于同种异体移植的“通用型供体”细胞来源。
其科学价值在于：首次系统性地将HLA I类和II类分子的关键调控因子同时敲除应用于hiPSCs，并综合评估了其对细胞多能性、分化后细胞功能（特别是复杂的三维电生理功能）以及免疫原性的全面影响，为开发低免疫原性干细胞产品提供了坚实的概念验证和详细的方法学与数据支持。
其应用前景巨大：这种“现货型”（off-the-shelf）的通用型hiPSCs细胞库，可以预先制备、质量控制和储存，随时用于急需治疗的急性疾病患者（如心肌梗死），避免了耗时数周至数月的自体细胞制备过程，大大提高了细胞治疗的可行性和及时性。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究团队在讨论部分引用了相关文献，将他们的发现置于更广阔的学术背景中。例如，他们提到在CIITA敲除的人内皮细胞中观察到的类似免疫逃避现象，以及有研究将B2M敲除并与HLA-E表达结合以同时逃逸T细胞和NK细胞识别的工作。本研究HLA-G的保留现象与这些研究相互呼应，共同勾勒出构建完美“免疫豁免”干细胞的不同技术路径和分子机制。此外，文中提到的hiPSCs自体移植仍存在免疫风险（如小鼠实验所示），进一步凸显了开发通用型细胞策略的必要性，即使对于未来个体化医疗也是如此。