这篇文档属于类型a，是一篇关于单分子电子隧穿电流检测蛋白质翻译后修饰的原创性研究论文。以下为详细学术报告：
作者及发表信息
本研究由Takahito Ohshiro、Makusu Tsutsui、Kazumichi Yokota、Masayuki Furuhashi、Masateru Taniguchi*和Tomoji Kawai*共同完成，作者单位均来自日本大阪大学产业科学研究所（The Institute of Scientific and Industrial Research, Osaka University）。研究发表于2014年9月14日的《Nature Nanotechnology》期刊，标题为《Detection of post-translational modifications in single peptides using electron tunnelling currents》。
研究领域与动机
蛋白质翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）通过肽键切割或氨基酸修饰基团的添加改变蛋白质功能，对生物调控至关重要（如酶活性开关、信号传导）。然而，传统质谱技术难以实现单分子水平的PTMs检测，且现有方法无法在单肽链尺度解析修饰位点。本研究旨在开发一种基于纳米电极电子隧穿电流的单分子检测技术，以解决这一技术瓶颈。
科学问题与目标
核心目标包括：
1. 验证单氨基酸分子通过纳米间隙电极时的隧穿电流信号特异性；
2. 区分磷酸化修饰（如磷酸酪氨酸phosphotyrosine, py）与非修饰氨基酸；
3. 实现表皮生长因子受体（EGFR）底物肽段的部分序列测定及磷酸化变体鉴别。
1. 纳米间隙电极制备
- 技术：采用机械可控断裂结（Mechanically Controllable Break Junctions, MCBJs）制备0.7 nm和0.55 nm两种宽度的金纳米间隙电极。
- 创新性：通过电子束光刻和反应离子刻蚀（CF4/O2气体）实现电极尺寸精确控制，其间隙宽度与氨基酸分子尺寸（约1 nm）匹配。
2. 单氨基酸检测
- 样本：20种L-氨基酸溶液（10 μM，磷酸盐缓冲液pH 7.4），包括磷酸酪氨酸（py）。
- 实验：在0.1 V偏压下记录分子通过电极间隙的隧穿电流（采样频率10 kHz），分析电流峰值（ip）和持续时间（td）。
- 数据分析：对至少500次电流信号构建高斯拟合直方图，提取特征电导值（128–953 pS）和持续时间（~1 ms）。
3. 肽段分析
- 样本：EGFR底物肽段（ieeeiygefd）及其磷酸化变体（ieeeipygefd），浓度100 nM。
- 信号解析：通过概率密度函数匹配电流信号，将未分辨氨基酸（如i、e、d）归为“x”组，部分序列通过长读长信号组装。
4. 磷酸化定量
- 混合溶液测试：调整y/py摩尔比（5:1和1:5），通过电导峰面积积分计算修饰比例，验证方法灵敏度。
1. 单氨基酸鉴别
- 0.7 nm间隙电极可明确检测8种氨基酸（如色氨酸W、酪氨酸y、苯丙氨酸f），其电导值差异显著（W最高953 pS，异亮氨酸i最低128 pS）。
- 0.55 nm间隙电极扩展至9种可检测氨基酸（如组氨酸h电导1088 pS），证实间隙尺寸对信号分辨率的影响。
2. 磷酸化修饰鉴别
- 磷酸酪氨酸（py）与非修饰酪氨酸（y）的电导峰值差异显著（py: 539 pS vs. y: 874 pS），持续时间相近（~2.5 ms）。
- 混合溶液中py/y比例检测结果（实验值87% vs. 理论值83%）验证了定量可行性。
3. 肽段序列解析
- 成功识别EGFR肽段中的y、f、py及x区域，通过电导图谱（图4h-j）重构部分序列（如xfxyx对应ieeei-y-gefd）。
- 磷酸化变体（ieeeipygefd）的电导峰（py: 394 pS）与非修饰肽段（y: 728 pS）明确区分。
科学意义
1. 技术突破：首次实现单肽链水平PTMs的电子隧穿检测，为单分子蛋白质组学提供新工具。
2. 应用潜力：可推广至其他修饰类型（如乙酰化、泛素化）的检测，助力精准医学中的蛋白质动态修饰研究。
亮点
- 方法创新：MCBJs纳米电极实现单分子电导的稳定测量，分辨率达亚纳米尺度。
- 跨学科融合：结合纳米技术、生物物理学与信息学（概率密度函数分析），推动单分子检测边界。
局限性
- 部分氨基酸（如g、e）因电导重叠未分辨，未来需优化电极材料或算法提升覆盖率。
本研究为《Nature Nanotechnology》封面论文，被同期评论称为“单分子蛋白质测序的重要里程碑”。其技术框架已延伸至DNA/RNA测序领域，展示广泛适用性。