一项关于恩格列净预处理间充质干细胞外泌体治疗心肌缺血再灌注损伤的研究

主要作者及发表信息

本研究的主要作者为Yuling Jing、Ying Cai、Qiuting Li等，通讯作者为Yang Yu和Chunxiang Zhang，其所属研究机构包括西南医科大学附属医院心血管内科、西南医科大学心血管研究所及教育部代谢性心血管疾病基础医学研究创新中心等。该研究成果于2025年发表在学术期刊《Stem Cell Research & Therapy》上。

研究背景

缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy, icm）是全球心血管疾病死亡的主要原因，其核心治疗方案——再灌注治疗，却常常引发离子失衡和活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量生成，加剧心肌细胞死亡，这一病理过程被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, miri）。目前的药物治疗效果有限，且具有出血、肝毒性和心律失常等风险。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, mscs）因具有再生治疗潜力而备受关注，其疗效主要归因于旁分泌信号，而非直接分化。外泌体（exosomes）作为mscs的关键旁分泌介质，能够通过减少凋亡、抑制炎症和促进血管新生来缓解icm。然而，未处理的mscs来源外泌体存在自然产量低和效力欠佳的问题，限制了其临床转化。已有研究表明，药物预处理（如阿托伐他汀、丹参酮IIA）是增强mscs外泌体疗效的可行策略。

钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors, sglt2is）是一类新型降糖药，其在心力衰竭、缺血性心肌病和心律失常中的心血管保护作用已被广泛证实。近期研究显示，sglt2is中的恩格列净（empagliflozin, empa）能够提高mscs的细胞活力与迁移能力，并抑制其凋亡和衰老。然而，sglt2is是否通过调节mscs外泌体来发挥对miri的治疗作用尚不清楚。此外，线粒体功能障碍是miri的核心特征，而线粒体自噬（mitophagy）是清除受损线粒体、维持稳态的关键机制。线粒体蛋白ATAD3A对线粒体自噬具有环境依赖性调控作用，但其在icm中是否调控PINK1/Parkin通路仍是未知。基于此，本研究旨在探究empa预处理的mscs来源外泌体（empa-exo）是否对miri展现出增强的心脏保护效应，并阐明其潜在机制。

研究流程与方法

研究分为体外和体内两大部分，包含多个连续的实验程序。

首先，研究者构建了empa预处理的骨髓间充质干细胞（bmscs）模型并分离外泌体。研究人员从小鼠骨髓中获取bmscs，并用不同浓度的empa（0.25 µM, 0.5 µM, 1 µM）处理，通过Western blot检测外泌体生物发生关键调节因子ALIX、nSMase2和Rab27A的蛋白水平，筛选出最佳处理浓度1 µM。随后，在bmscs融合度达80%时，用1 µM 的empa或无血清培养基处理24小时，使用商业试剂盒从上清液中分离得到外泌体（empa-exo）和未处理的外泌体（exo）。分离的外泌体通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, tem）鉴定形态，Western blot鉴定标志蛋白（CD9/CD63/CD81，钙连蛋白Calnexin），纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, nta）检测粒径分布和浓度，以及BCA法进行蛋白定量。此外，通过PKH67荧光标记实验验证了这两种外泌体均能在24小时内被心肌细胞有效摄取。

在体外实验中，研究者建立了心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia-reoxygenation, h/r）损伤模型。实验分为四组：正常对照组（NC）、模型组（H/R + PBS）、外泌体治疗组（H/R + exo）和empa外泌体治疗组（H/R + empa-exo）。原代新生小鼠心肌细胞（neonatal mouse cardiomyocytes, nmcms）与exo或empa-exo共培养24小时后，进行缺氧（95% N₂, 5% CO₂, 6小时）和复氧（4小时）处理。研究者通过MTT法检测心肌细胞活力，通过LDH释放实验评估细胞损伤程度，使用ROS探针检测细胞内活性氧水平，并采用流式细胞术及Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax和Bcl-2）来评估细胞凋亡情况。

在体内实验中，研究者构建了小鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion, i/r）模型。100只雄性C57BL/6小鼠被随机分为四组（每组25只）：假手术组（Control）、模型组（I/R + PBS）、exo治疗组（I/R + exo）和empa-exo治疗组（I/R + empa-exo）。通过结扎左前降支（left anterior descending, lad）冠状动脉30分钟后，在再灌注前将PBS或100 µg外泌体经心肌内五点注射（心尖、梗死区、边界区）进行递送。再灌注24小时后，通过心脏超声心动图评估心功能，检测参数包括左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, lvef）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, lvfs）等。之后处死小鼠取样，通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, he）染色观察心肌病理形态；通过TUNEL染色和Western blot检测心肌凋亡；通过伊文思蓝/TTC双染法评估心肌梗死面积；并利用Tem观察心肌超微结构，尤其关注线粒体形态和自噬体。

为探究机制，研究者在体内外模型中通过Western blot和免疫荧光（immunofluorescence）技术检测了ATAD3A和PINK1/Parkin通路相关蛋白（PINK1， Parkin, LC3B, p62）的表达水平。为进一步确认ATAD3A和PINK1的调控关系，研究者使用针对ATAD3A的小干扰RNA（sirna）在心肌细胞中敲低ATAD3A，然后检测PINK1的表达量。

主要研究结果

研究结果显示，empa预处理显著提升了bmscs的外泌体分泌能力。与未处理组相比，1 µM empa处理的bmscs，其外泌体颗粒浓度和蛋白含量均显著增加。免疫印迹结果表明，empa通过上调ALIX、nSMase2和Rab27A的表达来促进外泌体生物合成。

在体外H/R模型中，两种外泌体均能减轻心肌细胞损伤，但empa-exo的效果更为优越。具体而言，与exo组相比，empa-exo处理显著降低了促凋亡蛋白Bax的表达，增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并减少了晚期凋亡细胞和总凋亡细胞的比例。同时，empa-exo能更有效地提高细胞活力、降低LDH释放水平并抑制ROS的生成。

在体内I/R小鼠模型中，超声心动图结果表明，虽然两治疗组在改善心室壁厚度和内径方面与模型组无显著差异，但均能通过显著提升LVEF和LVFS来改善心脏功能，并且empa-exo的疗效显著优于exo。HE染色显示，empa-exo能更有效地减轻I/R诱导的炎症细胞浸润、心肌水肿、心肌纤维扭曲断裂和排列紊乱。TUNEL染色和Western blot凋亡蛋白检测结果一致表明，empa-exo在减轻心肌凋亡方面的效果比exo更为突出。TTC染色结果证实，empa-exo能更显著地缩小心肌梗死面积。

机制研究发现，ATAD3A的蛋白水平在H/R处理的心肌细胞和I/R损伤的小鼠心肌组织中均显著下降，且PINK1的表达也呈现一致的下调趋势。通过siRNA敲低ATAD3A后，PINK1的蛋白水平随之下降，证实了ATAD3A正向调控PINK1。进一步研究发现，exo和empa-exo处理均能显著上调H/R心肌细胞和I/R心肌组织中ATAD3A的表达，且empa-exo的上调效果更为显著。伴随ATAD3A的表达升高，PINK1、Parkin蛋白表达水平以及LC3II/I比值均显著增加，表明线粒体自噬被激活。虽然自噬底物蛋白p62表达也增加，但这可能提示自噬流通量尚未完全恢复。透射电镜结果显示，模型组小鼠心肌和线粒体肿胀，嵴减少，而两治疗组均能改善心肌水肿并观察到明显的自噬体结构，以empa-exo组的效果更为显著。

研究结论与价值

本研究的结论是：empagliflozin能通过上调ALIX、nSMase2和Rab27A的蛋白表达，促进骨髓间充质干细胞的外泌体分泌。两种外泌体均能通过上调ATAD3A蛋白表达，进而激活PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬来减轻心肌缺血再灌注损伤。尤为重要的是，empagliflozin预处理的外泌体在减少心肌细胞凋亡、改善心功能、缩小梗死面积方面的治疗效果显著优于未处理的外泌体。

本研究的科学价值在于首次揭示了sglt2抑制剂empagliflozin通过调节mscs外泌体分泌及其内含物发挥心血管保护作用的新机制，并阐明了ATAD3A/PINK1/Parkin轴在其中的关键角色，为干细胞外泌体治疗缺血性心脏病的机制提供了新见解。其应用价值在于提出了一种通过药物预处理优化mscs外泌体疗法的实用策略，即empagliflozin预处理不仅能显著增强外泌体的治疗效力，还能大幅提高其产量。这为克服当前msc外泌体临床转化中低产量和低效力的瓶颈提供了极具前景的解决方案。

研究亮点

本研究具有多个亮点。第一，发现了临床上广泛使用的降糖药empagliflozin可作为增强mscs外泌体产量和疗效的有效预处理剂，这种“老药新用”的策略具有很高的临床转化可行性。第二，研究首次证实在心肌缺血再灌注损伤模型中，线粒体蛋白ATAD3A是正向调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的关键分子，这与在某些癌症和脑缺血模型中观察到的抑制作用不同，揭示了ATAD3A功能的组织与疾病特异性。第三，研究将“药物预处理-外泌体产量/效力增强-线粒体自噬激活-心脏保护”串联成一个完整的逻辑链条，为未来开发更优化的mscs外泌体工程化修饰策略指明了新方向。研究也坦承其局限性在于未对empa-exo和exo中的具体活性成分进行深入比较和鉴定，这也是后续研究需要探索的方向。