关于安第斯正汉坦病毒NSS蛋白拮抗I型干扰素反应机制研究的学术报告
本研究由Jorge Vera-Otarola（第一作者）和Marcelo López-Lastra（通讯作者）领衔的团队完成，主要工作单位包括智利天主教大学分子病毒学实验室、智利千年免疫学与免疫治疗研究所、智利自治大学生物医学科学研究所、智利科学与生命基金会分子病毒学实验室、智利南方大学临床微生物学研究所以及阿根廷卡洛斯·G·马尔布兰博士国家卫生实验室与研究所国家传染病研究所。该研究成果已于2020年7月发表于《病毒学杂志》（Journal of Virology，卷94，期13，文章编号e00454-20）。
一、 研究背景
本研究属于病毒学与宿主免疫学交叉领域，聚焦于病毒如何逃逸宿主的先天免疫系统。具体研究目标为安第斯正汉坦病毒（Andes orthohantavirus, ANDV），这是布尼亚病毒目（Bunyavirales）汉坦病毒科（Hantaviridae）的一种啮齿动物携带病毒。ANDV是南美洲汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome, HCPS）的主要病原体，其特点是能够发生人与人之间的传播，疫情严重。病毒的先天免疫逃逸是其致病的关键。I型干扰素（type I IFN）反应是宿主抵抗病毒感染的第一道防线。当细胞内的RIG-I样受体（RLRs），如黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因I（RIG-I），检测到病毒RNA时，会通过其下游的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS，也称为IPS-1、VISA或Cardif）传递信号，最终激活干扰素调节因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB），诱导I型干扰素和促炎细胞因子的产生。
先前研究表明，ANDV感染在细胞和动物模型中仅能引发微弱的I型干扰素反应，病毒已进化出多种策略来延迟早期的干扰素诱导。已知ANDV的糖蛋白（Gn和Gc）以及核衣壳蛋白（N）在无病毒的实验系统中能够靶向干扰素诱导通路，发挥拮抗作用。然而，研究者注意到，单独或联合表达这些已知的拮抗蛋白，尚不能完全解释ANDV感染中观察到的总体干扰素表达抑制现象。这暗示着可能存在其他尚未被发现的病毒成分，共同参与对宿主抗病毒防御的全面压制。ANDV的小片段信使RNA除了编码N蛋白外，还从一个重叠的开放阅读框编码一个功能未知的非结构蛋白（Nonstructural protein, NSS）。研究团队之前仅在ANDV感染的细胞培养物中检测到NSS的表达。鉴于布尼亚病毒目中其他成员（如乌库涅米病毒）的NSS蛋白已被证明可作为干扰素拮抗剂，本研究旨在探究ANDV-NSS蛋白是否在感染过程中表达，以及其是否在拮抗宿主先天免疫、特别是I型干扰素反应中扮演重要角色。
二、 研究详细流程
本研究包含四个主要步骤，采用从体内到体外、从现象到机制的多层次验证策略。
第一步骤：验证ANDV-NSS蛋白在感染宿主体内的表达。 此前，ANDV-NSS的表达仅在细胞水平得到证实。为了确认其在真实感染情境下的存在，本研究使用了ANDV感染的叙利亚金黄地鼠动物模型。研究选取了三只经ANDV/Arg毒株（分离自长尾侏儒稻鼠）肌肉接种的地鼠，在接种后第8天（此时为病毒血症期，接近发病死亡时间点）处死动物，采集肺组织样本。作为对照，使用了模拟接种动物的肺组织。研究人员采用免疫组织化学方法，使用特异性针对ANDV N蛋白（阳性感染标志）和ANDV-NSS蛋白的一抗，对肺组织切片进行染色。结果显示，在感染动物的肺组织中，可以清晰观察到N蛋白和NSS蛋白的阳性染色（棕褐色），而对照动物或仅使用二抗的染色均为阴性。这一结果首次在实验感染的动物模型中证实了ANDV-NSS蛋白的表达，为其功能研究提供了重要的生物学相关性基础。
第二步骤：在无病毒系统中探究ANDV-NSS蛋白对I型干扰素通路的影响。 为了避免其他ANDV蛋白（如Gn、Gc、N）的干扰，研究采用病毒游离的转染系统来独立评估ANDV-NSS的功能。首先，在HEK 293T细胞中，共转染表达ANDV-NSS（血凝素HA标签标记）的质粒与一系列能激活干扰素通路的效应蛋白（Flag标签标记的MDA5、RIG-I的2CARD结构域、MAVS、TBK1或组成性活化的IRF3-5D）的表达质粒。同时，共转染报告基因系统：以干扰素-β启动子（IFN-β–Fluc）或NF-κB、IRF3、干扰素刺激反应元件（ISRE）启动子驱动的萤火虫荧光素酶（Fluc）报告质粒，以及作为内参的SV40启动子驱动的海肾荧光素酶（Rluc）报告质粒。实验设置了多个对照：空载体（HA-EV）、已知的强干扰素拮抗剂流感病毒NS1蛋白（IAV-NS1）、以及已知不抑制RLR通路的辛诺柏病毒N蛋白（SNV-N）。转染18小时后，进行双荧光素酶报告基因检测，通过Fluc/Rluc比值量化干扰素通路的激活程度，并通过蛋白质印迹验证各蛋白的表达。
第三步骤：探究ANDV-NSS蛋白与MAVS的相互作用及其机制。 基于第二步的结果发现ANDV-NSS作用于MAVS水平，研究者深入探索其分子机制。首先，通过免疫共沉淀实验验证蛋白间相互作用。在HEK 293T细胞中，共转染表达Flag-MAVS、Flag-TBK1以及HA-EV或HA-NSS的质粒。裂解细胞后，分别使用抗HA或抗TBK1的抗体进行免疫沉淀，然后通过蛋白质印迹检测共沉淀的蛋白。其次，为了探究ANDV-NSS是否影响MAVS的稳定性，研究者转染不同剂量的HA-NSS质粒，同时考察对内源性MAVS或过表达Flag-MAVS蛋白水平的影响，通过蛋白质印迹分析蛋白丰度。再者，鉴于MAVS的泛素化及其形成的朊病毒样多聚体对其激活至关重要，研究设计了泛素化分析实验。在HEK 293T细胞中，共转染HA标记的泛素（HA-Ub）、Flag-MAVS以及HA-EV或HA-NSS质粒，并用蛋白酶体抑制剂MG-132处理。通过免疫沉淀Flag-MAVS，然后用抗HA抗体检测其泛素化水平。
第四步骤：在更贴近病毒感染生理环境的细胞系中验证关键发现。 为了确认上述在HEK 293T细胞中的发现具有更广泛的生物学意义，研究回到了最初观察到ANDV抑制IRF3激活的Huh-7人肝癌细胞系进行验证。首先，通过免疫荧光实验，观察共转染绿色荧光蛋白标记的IRF3（GFP-IRF3）、Flag-MAVS以及mCherry标记的ANDV-NSS后，IRF3的核转位是否被NSS蛋白抑制。其次，为了直观证实ANDV-NSS与MAVS在细胞内的直接相互作用，研究采用了原位邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）。在Huh-7细胞中，分别共转染HA-NSS与Flag-MAVS，或单独转染HA-NSS，然后使用针对HA和Flag（或内源性MAVS）的一抗进行PLA检测。PLA信号（红色荧光点）的出现表明两个目标蛋白在细胞内空间距离非常接近（<40 nm），强烈提示直接相互作用。
三、 主要研究结果
1. ANDV感染拮抗RLR通路诱导的IRF3激活。 在Huh-7细胞中，过表达RIG-I的2CARD结构域或MAVS均可有效诱导GFP-IRF3从细胞质转位至细胞核（阳性对照）。然而，当细胞预先感染ANDV后，即使过表达RIG-I-2CARD或MAVS，在表达病毒N蛋白（指示感染）的细胞中，GFP-IRF3也主要停留在细胞质中，核转位被显著抑制。这证明ANDV感染不仅自身不激活IRF3，还能主动拮抗由上游信号分子触发的IRF3激活。
2. ANDV-NSS蛋白靶向MAVS，抑制其下游信号传导。 双荧光素酶报告基因实验结果显示： * ANDV-NSS蛋白能显著抑制由MDA5或RIG-I过表达所激活的IFN-β启动子活性（抑制率分别为68%和53%），但对由更下游的TBK1或组成性活化的IRF3-5D所激活的启动子活性没有影响。这表明ANDV-NSS的作用位点在MDA5/RIG-I的下游，TBK1的上游。 * 进一步聚焦于关键接头蛋白MAVS，发现ANDV-NSS能剂量依赖性地抑制由MAVS过表达所诱导的IFN-β、NF-κB、IRF3及ISRE启动子的活性（抑制率在52%至74%之间），其拮抗效果弱于IAV-NS1，但显著区别于无活性的SNV-N和空载体。 * 逆转录定量PCR实验证实，ANDV-NSS能够拮抗MAVS过表达诱导的内源性IFN-β mRNA的转录（将诱导倍数从25倍降低至8倍）。
3. ANDV-NSS与MAVS发生相互作用，但不破坏MAVS-TBK1复合物，而是减少MAVS的泛素化。 * 相互作用验证： 免疫共沉淀实验显示，HA-NSS蛋白能够与Flag-MAVS发生特异性共沉淀，表明两者在细胞内存在物理相互作用。PLA实验在Huh-7细胞中进一步证实了ANDV-NSS与过表达的Flag-MAVS以及内源性MAVS均存在近距离相互作用。 * 不影响稳定性与TBK1结合： 蛋白质印迹分析表明，过表达ANDV-NSS并不降低内源性或过表达MAVS的蛋白水平，说明其不通过降解MAVS来发挥作用。同时，免疫共沉淀实验显示，在ANDV-NSS存在的情况下，MAVS与TBK1的相互作用依然存在，表明其抑制机制不同于某些通过解离该复合物起作用的病毒蛋白。 * 影响泛素化： 关键机制发现：在ANDV-NSS存在的情况下，MAVS的泛素化水平明显降低。这提示ANDV-NSS可能通过干扰MAVS的泛素化修饰过程，从而抑制其形成功能性多聚体并激活下游信号的能力。
4. 在Huh-7细胞中的功能与互作验证。 免疫荧光实验显示，ANDV-NSS的表达能够阻止MAVS过表达所诱导的GFP-IRF3核转位。PLA实验提供了ANDV-NSS与MAVS在细胞内直接相互作用的可视化证据。这些结果与在HEK 293T细胞中的发现相互印证，证实了ANDV-NSS靶向MAVS作用的普适性。
四、 研究结论与意义
本研究得出了明确结论：ANDV编码的NSS蛋白是一种新型的I型干扰素反应拮抗剂。它通过在感染过程中表达，与宿主细胞的关键先天免疫信号接头蛋白MAVS相互作用，并减少MAVS的泛素化，从而抑制MAVS下游的信号传导，最终阻碍IRF3的激活和I型干扰素的产生。
其科学价值在于： 1. 发现新功能蛋白： 首次明确了ANDV-NSS蛋白的生物学功能，揭示了ANDV-S基因片段编码的第二个具有免疫调节功能的蛋白，扩展了对ANDV基因组编码潜力和致病机制的理解。 2. 阐明新逃逸机制： 揭示了一种新的汉坦病毒免疫逃逸策略，即靶向MAVS的泛素化过程。这为理解高致病性汉坦病毒如何精细调控宿主免疫反应提供了新的分子细节。 3. 解释临床现象： 该发现有助于解释为何ANDV感染早期I型干扰素反应微弱。NSS蛋白与已知的Gn、Gc和N蛋白可能构成一个多层次的、冗余的干扰素拮抗网络，确保病毒在感染初期能有效复制。 4. 提供潜在靶点： 对ANDV-NSS蛋白作用机制的深入研究，可能为开发针对汉坦病毒感染的新型抗病毒策略（如干扰病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用）提供理论依据和潜在靶点。
五、 研究亮点
六、 其他有价值内容
本研究还提及了与同行研究（Cimica等，2014）的表面“冲突”并进行了合理解释。Cimica等的研究表明ANDV-N蛋白本身即可拮抗干扰素信号，且其功能不依赖于NSS。本研究的作者指出，他们的工作并非否定前者的发现，而是揭示了S基因片段编码的另一个蛋白（NSS）也具有独立的免疫调节功能。两者共同说明了ANDV-S基因片段在免疫逃逸中的重要性，其编码的两个蛋白可能协同或在不同层面发挥作用，这更凸显了病毒拮抗策略的复杂性。这种对前人工作的客观讨论体现了严谨的学术态度。