本研究题为“Decreased PIBF1/IL6/p-STAT3 during the mid-secretory phase inhibits human endometrial stromal cell proliferation and decidualization”，由Mingjuan Zhou, Huihui Xu, Dan Zhang, Chenchen Si, Xiaowei Zhou, Hui Zhao, Qiang Liu, Bufang Xu, Aijun Zhang 等人合作完成。作者单位主要包括上海交通大学医学院附属瑞金医院生殖医学中心、妇产科以及上海交通大学医学院组织胚胎学、遗传学与发育生物学系。该研究发表于Journal of Advanced Research期刊的2021年第30卷。
本研究聚焦于生殖医学领域一个棘手的临床问题——反复种植失败（Recurrent Implantation Failure， RIF）。在辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology， ART）中，RIF是指在至少三次胚胎移植周期、累计移植至少四个高质量胚胎后仍未能获得临床妊娠。约有10%接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的女性受此困扰，给她们带来了巨大的情感和经济负担。胚胎植入失败主要与子宫内膜容受性不足和胚胎质量有关，而前者被认为是RIF的主要原因。在着床窗口期，子宫内膜基质细胞的蜕膜化对于获得容受性至关重要，而基质细胞的适当增殖是蜕膜化的必要条件。
孕酮诱导阻断因子1（Progesterone-Induced Blocking Factor 1， PIBF1）最初在生育女性经孕酮处理的淋巴细胞中发现，对细胞增殖有重要影响。既往研究表明，PIBF1低表达与流产、早产和子痫前期有关，并且有报道称PIBF1能诱导小鼠子宫内膜基质细胞发生蜕膜样转化，但其具体机制尚不清楚。在研究者前期的微阵列分析中，发现PIBF1在RIF患者的子宫内膜中显著下调。因此，本研究首次探究了分泌中期PIBF1表达降低对RIF患者子宫内膜容受性的影响。
本研究的目的是：首先，明确PIBF1在正常月经周期及RIF患者分泌中期子宫内膜中的表达模式；其次，探究PIBF1对子宫内膜细胞增殖及蜕膜化的调控作用；最后，阐明PIBF1是否通过白细胞介素-6/磷酸化信号转导与转录激活因子3（IL6/p-STAT3）信号通路来发挥作用。
本研究设计严谨，整合了临床样本分析、生物信息学挖掘与体外功能实验，主要包含以下流程：
1. 研究对象与样本收集 研究获得上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准。研究对象分为两组： * 对照组：因子宫输卵管阻塞或不明原因不孕，在首次胚胎移植后即获得临床妊娠的女性。 * RIF组：经历至少3次胚胎移植（累计≥4个高质量胚胎）仍未妊娠的女性。 所有参与者年龄25-35岁，月经周期规律，内分泌正常，并排除了一系列干扰因素（如宫内病变、子宫内膜异位症等）。
根据月经周期（依据Noyes标准），从58名对照组受试者中收集了不同时期的子宫内膜样本：增殖早、中、晚期，分泌早、中、晚期。所有样本均在自然周期的特定日期（例如，分泌中期为LH+7天）通过抽吸刮宫术采集。RIF组的20份样本在至少3次失败周期后的一个自然周期的LH+7天采集。部分样本用于分析PIBF1及相关分子表达，部分用于分离原代细胞。
2. 微阵列数据分析 研究者分析了来自基因表达综合数据库的三个数据集：包括自己团队之前发表的GSE103465（3名对照，3名RIF患者），以及GSE58144和GSE111974。通过R包中的limma算法筛选差异表达基因，并利用STRING数据库对与PIBF1相关性最高的300个基因构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络，以识别枢纽基因。
3. 分子表达水平检测 * 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：检测子宫内膜组织和培养细胞中PIBF1、IL6、MKI67、PRL、IGFBP1等基因的mRNA表达水平。 * 蛋白质印迹法（Western Blot）：检测相应蛋白的表达水平，包括PIBF1、IL6、p-STAT3、STAT3、HOXA10、PRL、IGFBP1等。 * 免疫组织化学（IHC）染色：对石蜡包埋的子宫内膜组织切片进行染色，定位并半定量分析PIBF1、Ki-67蛋白的表达。 * 酶联免疫吸附试验（ELISA）：测定细胞培养上清液中IL6的分泌水平。
4. 细胞实验 * 细胞培养与鉴定：分离并培养原代人子宫内膜基质细胞（Human Endometrial Stromal Cells， HESCs）和上皮细胞（HEECs），同时使用人子宫内膜腺癌细胞系（Ishikawa）。通过免疫细胞化学染色（波形蛋白Vimentin用于基质细胞，细胞角蛋白Cytokeratin 7用于上皮细胞）验证细胞纯度（>95%）。 * 基因操作：通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）敲低PIBF1表达，以及通过质粒转染过表达PIBF1或IL6。 * 细胞增殖测定：使用CCK-8试剂盒检测Ishikawa细胞和HESCs的增殖。对于HEECs，由于操作困难，改用增殖标志物MKI67的mRNA表达水平来评估增殖。 * 体外蜕膜化实验：将从增殖晚期子宫内膜分离的HESCs，在基因操作后，用包含β-雌二醇、孕酮和8-Br-cAMP的血清游离培养基处理48小时，诱导蜕膜化。通过检测蜕膜化标志物催乳素（PRL）和胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP1）的mRNA和蛋白水平来评估蜕膜化程度。 * 信号通路验证：通过添加IL6中和抗体，验证IL6在PIBF1/STAT3通路中的作用。
5. 数据分析 连续变量采用双尾Student’s t检验比较两组差异。多组间比较采用方差分析（ANOVA）和Bonferroni检验。分类变量采用Fisher精确检验。使用SPSS软件处理数据，统计显著性设定为P < 0.05。
1. PIBF1在子宫内膜中的表达模式及在RIF患者中的下调 在对照组子宫内膜中，PIBF1的mRNA和蛋白水平在增殖期较低，在分泌早期升高，并在分泌中期达到峰值。免疫组化显示，PIBF1定位于子宫内膜的上皮层和基质层。重要的是，与对照组相比，RIF患者在分泌中期子宫内膜的基质层中，PIBF1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。同时，已知的子宫内膜容受性标志物HOXA10的表达在RIF组也显著降低。对GEO数据库其他数据集的荟萃分析也支持PIBF1在RIF患者中下调的结论。生物信息学分析发现，STAT3是PIBF1相关互作网络中的一个枢纽基因。此外，体外实验证实，孕酮能以剂量依赖的方式诱导HESCs中PIBF1的表达。
2. PIBF1通过IL6/p-STAT3通路调控基质细胞增殖 在Ishikawa细胞和HESCs中，敲低PIBF1能显著下调IL6的表达、STAT3的磷酸化水平以及细胞的增殖活性。而过表达PIBF1或IL6则能逆转这些效应，并恢复细胞增殖。使用IL6中和抗体可以阻断PIBF1过表达引起的p-STAT3水平升高和增殖促进，证实了IL6在该通路中的介导作用。然而，在HEECs中，敲低或过表达PIBF1对IL6表达和增殖标志物MKI67的影响均无统计学意义。这表明PIBF1主要通过作用于基质细胞来影响内膜功能。
3. PIBF1调控基质细胞蜕膜化 在体外蜕膜化模型中，敲低HESCs中的PIBF1，会导致蜕膜化标志物PRL和IGFBP1的表达下降，同时伴随IL6和p-STAT3水平的降低。相反，过表达PIBF1或IL6则能显著提升这些分子的表达，促进蜕膜化。这清晰地表明，PIBF1通过IL6/p-STAT3信号通路正向调控子宫内膜基质细胞的蜕膜化过程。
4. RIF患者子宫内膜中下游效应分子的验证 与体外实验结果一致，RIF患者在分泌中期的子宫内膜组织中，IL6、p-STAT3、PRL和IGFBP1的mRNA和/或蛋白水平均显著低于对照组。同时，代表细胞增殖活性的标记物Ki-67在基质层中的染色强度也在RIF组中明显降低。这些体内数据有力地支持了PIBF1/IL6/p-STAT3通路在RIF患者子宫内膜中功能减弱的结论。
本研究得出结论：在月经周期的分泌中期，PIBF1的表达达到高峰，这对于获得子宫内膜容受性至关重要。在RIF患者中，分泌中期子宫内膜的PIBF1表达显著降低，进而导致IL6表达下降和STAT3磷酸化减弱。这一信号通路的抑制，最终阻碍了子宫内膜基质细胞的正常增殖和蜕膜化过程，从而降低了子宫内膜容受性，这可能是导致胚胎反复植入失败的重要原因之一。
科学价值：本研究首次系统揭示了PIBF1在人类子宫内膜容受性建立中的关键作用及其分子机制——通过调控IL6/p-STAT3信号通路影响基质细胞增殖与蜕膜化。这为理解RIF的病理生理学提供了新的视角和理论依据，将PIBF1确立为子宫内膜功能的一个潜在重要调节因子。 临床应用价值：PIBF1及其下游分子（IL6， p-STAT3）可能成为诊断子宫内膜容受性不良和RIF的新型生物标志物。针对PIBF1/IL6/STAT3通路的干预措施（例如，局部补充或激活该通路）有望成为未来改善RIF患者妊娠结局的潜在治疗策略。本研究为开发此类靶向疗法奠定了理论基础。
研究中指出，虽然PIBF1表达受孕酮诱导，但在RIF组患者活检日血清孕酮水平并未降低，这提示分泌中期PIBF1的下调可能还受到孕酮之外的其他因素影响，例如IL-33浓度、B细胞数量或线粒体DNA拷贝数等。这为后续研究指明了方向，即探索导致PIBF1下调的上游因素。此外，作者建议未来应利用动物模型进一步研究PIBF1下调的机制及其调控子宫内膜容受性的更深层机制。