本研究由江苏省中医院临床药理科的李长印、邹建东，以及中国药科大学天然药物国家重点实验室的刘鄂湖等研究者合作完成。尤青与林洋为共同第一作者。该研究成果于2024年11月19日在线发表于Journal of Chromatography B（卷1250，文献号124378），并收录于ScienceDirect数据库。
糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常见且严重的微血管并发症之一，约有20%–40%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者会发展为DKD。超过40%的终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）由DKD引起。目前临床治疗以降糖、降脂、降压为主，但这些手段难以有效阻断DKD向ESRD进展，患者死亡率较无肾病的糖尿病患者高30倍，因此亟需开发新的治疗策略。
芪葵颗粒（Qikui Granule，QKG）是江苏省中医院的院内制剂，由黄芪（*Astragali Radix*）、黄蜀葵花（*Abelmoschi Corolla*）和制何首乌（*Polygoni Multiflori Radix Praeparata*）三味中药组成。中医理论认为“湿热深伏肾络”是DKD的重要病机，而QKG具有清热利湿、益气养阴的功效。既往临床与动物实验已初步证实QKG可降低尿微量白蛋白、延缓DKD进展，但由于中药“多成分、多靶点、多途径”的特点，其整体疗效与深层机制尚未阐明。
为此，本研究旨在利用网络药理学（network pharmacology）、16S rRNA基因测序（16S rRNA sequencing） 与非靶向脂质组学（non-targeted lipidomics） 三种技术联用的整合策略，以db/db小鼠为DKD模型，系统探究QKG抗DKD的整体作用及其与肠道菌群和脂质代谢相关的潜在机制。
1. QKG化学成分分析 研究团队首先采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS），基于前期已建立的化学表征方法，对QKG制剂进行质量控制与成分确证。共鉴定出53个化学成分，其中黄酮类25个、皂苷类11个、氨基酸类5个、醌类2个、糖类2个、核苷类2个及其他类6个。这些成分信息为后续网络药理学靶点预测提供了可靠的物质基础。
2. 网络药理学分析 基于前期从QKG中鉴定的71个化学成分，利用Swiss Target Prediction数据库预测药物对应靶点，共获得356个靶点；同时从TTD、DrugBank、GeneCards和DisGeNET数据库收集DKD相关靶点，去重后得到2856个疾病靶点。通过Venny软件取交集获得218个共同靶点，并构建“成分-靶点”网络。进一步利用STRING数据库构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络，以高置信度（>0.9）筛选，最终通过网络拓扑参数（degree centrality、betweenness centrality、closeness centrality、eigenvector centrality）确定46个核心靶点。DAVID数据库KEGG通路富集分析提示，PI3K-Akt、EGFR、MAPK、JAK-STAT、FoxO、AGE-RAGE等信号通路与QKG疗效最为相关。值得注意的是，这些通路在文献中均与脂质代谢及肠道菌群调控密切相关。
3. 动物实验设计 研究采用8周龄雄性C57BL/KSJ-db/db小鼠（DKD模型）与C57BL/KSJ-db/m小鼠（正常对照）。小鼠适应性饲养1周后，24只db/db小鼠随机分为三组：模型组（DKD）、QKG组（9 g/kg/天灌胃）和阳性药厄贝沙坦组（irbesartan，IBST，22.75 mg/kg/天灌胃）；另设8只db/m小鼠为正常组（NC）。药物剂量均为临床最高日剂量的等效折算。各组每日给药一次，连续15周（9周龄至24周龄）。实验期间每周记录体重，每4周测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。24周龄时收集12小时尿液并取血、盲肠内容物和肾组织，用于后续生化、组织病理、16S rRNA测序及脂质组学分析。
4. 生化与组织病理检测 肾功能指标包括尿微量白蛋白（microalbumin，MALB）、尿肌酐（creatinine，CR）、尿微量白蛋白排泄率（albumin excretion rate，AER）和尿微量白蛋白/肌酐比值（urine microalbumin-to-creatinine ratio，UACR）；氧化应激指标包括尿8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）。肾组织经H&E染色后光镜下观察病理改变。
5. 16S rRNA基因测序与生物信息学分析 取NC、DKD和QKG三组小鼠盲肠内容物，提取基因组DNA，扩增16S rRNA基因V3–V4可变区（引物341F-806R），在Illumina NovaSeq PE250平台进行双端测序。测序数据经Majorbio云平台处理，计算α多样性（Shannon指数、稀释曲线）、β多样性（PCoA），并在门和属水平进行物种注释与差异分析，利用Wilcoxon秩和检验筛选组间差异菌属。
6. 非靶向脂质组学分析 血清和肾组织样本经甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水体系提取脂质，采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS在正、负离子模式下采集数据。流动相采用CSH C18色谱柱，乙腈/水（60:40，含10 mM甲酸铵）和乙腈/异丙醇（10:90，含10 mM甲酸铵）梯度洗脱；正离子模式另加0.1%甲酸。质控（QC）样本每8个实际样本插入一次。原始数据经MS-DIAL预处理后，利用SIMCA-P 14.0进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。以VIP>1、p<0.05且FC>1.2或<0.833为筛选标准，结合HMDB、MONA、PubChem等数据库进行脂质鉴定。所获得的差异脂质按“疾病潜在生物标志物（potential disease biomarkers，PDBs）”和“药效潜在生物标志物（potential pharmacological biomarkers，PPBs）”分类。PPBs指在DKD vs NC和QKG vs DKD比较中均具有统计学意义且变化趋势相反的脂质。
7. 通路富集与相关性分析 利用Chemical Similarity Enrichment Analysis（ChemRICH）和MetaboAnalyst 5.0分别进行脂质类别富集和代谢通路富集分析。Spearman相关分析用于评估PPBs、差异菌属与显著生化指标之间的相关性。
1. 网络药理学预测 “成分-靶点”网络包含90个节点、2306条边。3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷（degree=69）、棉黄素（gossypetin，degree=65）和杨梅素（myricetin，degree=64）的靶点连接度最高，被认为是QKG抗DKD的关键活性成分。PI3K-Akt等六条信号通路被预测为QKG的核心作用机制，而这些通路均与脂质代谢和肠道菌群存在双向调控关系。
2. QKG对DKD表型的改善作用 与DKD组相比，QKG组小鼠体重从21周龄起显著下降（p<0.05）；FBG虽在早期有下降趋势，但20周龄后反而升高，提示QKG的肾脏保护作用并非依赖降糖。肾功能方面，QKG显著降低MALB、CR和UACR水平，对AER无显著影响；同时显著降低8-OHdG和MDA水平，表明QKG可明显减轻氧化应激。H&E染色显示，QKG可不同程度逆转DKD引起的肾小管扩张、上皮细胞脱落和空泡变性。
3. 肠道菌群调节作用 16S rRNA测序共获得4,249,630条高质量reads，平均长度423 bp，检出1,789个操作分类单元（OTUs）。α多样性分析显示，DKD组Shannon指数显著低于NC组（p<0.05），而QKG组较DKD组显著回升，提示QKG可恢复菌群多样性。β多样性PCoA显示，QKG组样本位于DKD与NC之间，表明菌群结构紊乱得到部分纠正。门水平上，DKD组厚壁菌门（Firmicutes） 相对丰度升高、拟杆菌门（Bacteroidetes） 和变形菌门（Proteobacteria） 降低，QKG可逆转该变化。F/B比值在DKD组显著升高，QKG组虽有下降但未达统计学差异。属水平差异筛选发现，DKD组中Candidatus_Arthromitus丰度显著低于NC组，而QKG治疗后其丰度显著回升（p<0.05），且该菌是唯一被QKG显著逆转的差异菌属，提示其可能是介导QKG药效的关键有益菌。
4. 脂质代谢谱的恢复 QC样本在四种采集模式下色谱峰重叠良好，PCA图中QC样本紧密聚集，证明分析系统稳定可靠。OPLS-DA显示，DKD与NC组在血清和肾组织中均呈现明显分离，而QKG组位于两组之间，提示QKG能部分恢复DKD诱导的脂质代谢紊乱。值得注意的是，IBST组与DKD组几乎重叠，说明厄贝沙坦对脂质代谢紊乱的纠正作用有限。
通过筛选与鉴定，共得到66个血清PDBs（正离子模式30个，负离子模式36个）和260个肾PDBs（正离子模式224个，负离子模式36个）。其中，21个血清PDBs和6个肾PDBs被QKG显著逆转，合并去重后共26个PPBs。热图与层次聚类分析显示，QKG组样本在聚类树中更靠近NC组，进一步支持了QKG对脂质异常的恢复作用。
5. 通路富集与相关性分析 ChemRICH分析显示，血清PDBs中磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines，PC）、溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholines，LPC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositols，PI）、甘油三酯（triglycerides，TG） 和不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFA） 在DKD组均升高；肾PDBs涉及更多类别，包括饱和/不饱和PC、LPC、PE、PI、TG、神经酰胺、鞘磷脂等。KEGG通路富集显示，DKD状态下血清脂质紊乱主要涉及不饱和脂肪酸生物合成、甘油酯代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢和类固醇激素生物合成；肾脏则涉及鞘脂代谢、脂肪酸合成与降解等9条通路。对26个QKG相关PPBs的通路富集则持续聚焦于甘油磷脂代谢（glycerophospholipid metabolism），该通路在三次独立富集分析中均被显著富集，提示其为QKG改善DKD脂质紊乱的核心通路。
Spearman相关分析显示，Candidatus_Arthromitus与MALB、CR、UACR、8-OHdG、MDA这5个生化指标均呈显著负相关；更为重要的是，该菌与26个PPBs中的22个呈显著负相关，包括多种PC和LPC分子。这些结果表明，QKG可能通过上调肠道Candidatus_Arthromitus丰度，抑制异常激活的PI3K-Akt相关信号通路，从而降低甘油磷脂代谢中PC和LPC的水平，最终延缓DKD进展。
本研究首次采用网络药理学、16S rRNA测序与非靶向脂质组学的整合策略，从“药物靶点—肠道菌群—脂质代谢”多维度揭示了QKG抗DKD的整体机制。研究证实，QKG可显著改善db/db小鼠的肾功能指标、氧化应激状态和肾小管病理损伤，恢复DKD引起的肠道菌群紊乱，并以Candidatus_Arthromitus为核心靶菌，调节甘油磷脂代谢中PC和LPC等关键脂质，最终发挥肾脏保护作用。
本研究的科学价值在于：（1）系统验证了QKG的体内抗DKD疗效，并明确了其不依赖降糖的肾保护特性；（2）首次将Candidatus_Arthromitus与DKD脂质代谢紊乱关联，为“肠-肾轴”理论提供了新的实验证据；（3）建立了基于“成分-靶点-菌群-代谢物”的多层网络整合分析范式，为中药复方整体机制研究提供了可借鉴的方法学框架。
在应用价值方面，QKG作为已在临床使用十余年的院内制剂，其安全性和有效性具备一定基础。本研究为QKG的临床定位及进一步开发提供了现代科学依据，尤其为DKD合并脂质代谢紊乱患者的治疗提供了潜在的中药选择。同时，Candidatus_Arthromitus和多种PC/LPC分子有望作为评估QKG疗效或DKD进展的潜在生物标志物。
本研究的突出亮点包括：第一，方法学上实现了网络药理学预测、菌群测序和脂质组学三种技术在同一DKD模型中的有机整合，而非简单拼合；第二，首次明确了Candidatus_Arthromitus是QKG干预后唯一被显著逆转的差异菌属，并将其与多个脂质标志物和临床相关指标建立了量化关联；第三，发现QKG对脂质代谢的恢复作用显著优于阳性药厄贝沙坦，提示其在改善DKD代谢紊乱方面可能具有西药无法替代的优势；第四，本研究基于实际鉴定的QKG化学成分而非网络数据库进行靶点预测，大大提高了网络药理学分析的可靠性。
该研究为中药复方治疗DKD的多靶点、多途径作用提供了系统的现代科学阐释，也为后续基于“菌群-脂质-信号通路”轴的DKD干预策略开发奠定了实验基础。