针对类风湿关节炎骨侵蚀的微流控芯片共培养模型：一项创新的体外研究平台
本研究由大连医科大学的 Hui-peng Ma、Xue Deng、Deng-yi Chen、Di Zhu、Jin-ling Tong、Ting Zhao、Jin-hui Ma 和 Yan-qiu Liu 共同完成，通讯作者为 Yan-qiu Liu。该研究以题为“A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation”发表于 Royal Society Open Science 期刊，于2018年4月12日接收，同年8月21日接受发表。
一、 学术背景 本研究属于生物医学工程与风湿病学交叉领域，具体涉及细胞生物学、组织工程和药物筛选技术。类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种慢性系统性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎为特征。其中，成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like Synoviocytes, FLS）的异常增殖、迁移和侵袭在RA的发病机制中扮演关键角色。活化的FLS会分泌多种促炎因子和基质破坏酶，如基质金属蛋白酶（MMPs），进而促进关节部位的骨侵蚀。骨侵蚀是RA诊断、治疗和监测的核心要素之一，其本质是破骨细胞介导的骨吸收超过了成骨细胞介导的骨形成所导致的局部骨丢失。理解骨侵蚀的形成机制，需要深入探究FLS与破骨细胞、成骨细胞之间的相互作用。
然而，传统的体外研究模型（如静态培养、Transwell小室等）通常只能单独研究FLS或骨细胞，难以模拟体内RA复杂的多细胞相互作用和三维微环境，与真实的病理条件存在较大差距。此外，现有的药物筛选模型大多无法同时靶向FLS介导的滑膜炎和骨侵蚀这两个关键病理过程。因此，开发一种能够模拟FLS迁移侵袭介导的骨侵蚀过程，并能用于药物敏感性测试的可靠平台，对于指导RA治疗和新药研发至关重要。
微流控芯片技术因其能够精确控制微环境、模拟组织/器官的生理病理状态，并实现高通量、低试剂消耗的分析，已成为生物医学研究的有力工具。本研究的目标正是利用微流控芯片技术，构建一个能够共培养FLS、破骨细胞前体细胞和成骨细胞前体细胞（骨髓间充质干细胞，Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSC）的仿生平台，用以模拟RA中FLS迁移侵袭介导的骨侵蚀过程，并评估抗RA药物（以雷公藤红素Celastrol为例）在该病理过程中的干预效果。
二、 详细研究流程 本研究的工作流程主要包括微流控芯片的设计与制备、细胞培养与分化、共培养模型建立、细胞迁移与功能检测、以及药物评价等多个环节。
微流控芯片设计与制备：研究团队设计并制作了一种双层结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片。芯片的核心设计包含多个共培养单元。每个单元设有一个用于培养FLS的中央通道，中央通道两侧各有一个用于灌注培养基的侧通道。关键的设计在于通道高度差异：中央通道高度为180微米，而其他部分（包括侧通道和细胞培养腔室）高度为65微米。这种高度差使得两种不同类型的细胞可以顺序性地被引入各自的腔室，实现物理隔离但化学信号可通的共培养。芯片的模具通过光刻技术制作在硅片上，随后浇注PDMS预聚物并固化，最后将PDMS层与玻璃基底通过等离子体处理进行不可逆键合，形成封闭的微流道网络。
细胞来源与培养：
共培养模型建立与实验分组：在芯片使用前，首先在连接中央通道和侧腔室的微通道内预包被Matrigel（一种基底膜基质替代物），以模拟体内细胞外基质屏障。随后，将SW982细胞接种于中央通道，使其附着形成单层。在侧方的细胞培养腔室中，分别或共同接种经RANKL刺激的RAW264.7细胞和/或经成骨诱导的BMSC。这样就构建了FLS与不同骨相关细胞（破骨细胞、成骨细胞或二者混合）间接共培养的体系。实验设置了不同的共培养条件组，以比较FLS对不同刺激的迁移反应。
检测指标与方法：
数据分析：实验数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间差异比较，使用SPSS 17.0软件处理。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
三、 主要研究结果 1. FLS迁移行为的差异：在建立的微流控共培养模型中，FLS（SW982细胞）表现出向骨相关细胞迁移的能力。迁移程度因共培养对象的不同而异。当FLS与RANKL刺激的RAW264.7细胞（破骨细胞前体）共培养时，其迁移数量和距离显著增加。当FLS与成骨诱导的BMSC共培养时，迁移程度相对较低。然而，当FLS同时与RAW264.7和BMSC共培养时，其迁移能力最为显著，迁移细胞数量和迁移率均达到最高。这一结果模拟了RA滑膜中活化的FLS向骨组织侵袭的过程，并提示破骨细胞及其分泌的因子对FLS具有更强的趋化作用。
Cadherin-11表达的变化：免疫荧光结果显示，FLS中Cadherin-11的表达水平受共培养环境影响。与BMSC共培养相比，与RAW264.7细胞共培养能上调FLS中Cadherin-11的表达。更重要的是，在同时与RAW264.7和BMSC共培养的组中，发生迁移的FLS表现出更高的Cadherin-11表达水平。这提示Cadherin-11可能与FLS的迁移和侵袭表型密切相关，尤其是在复杂的骨微环境中。
骨细胞功能活性的改变：通过Alp和Trap染色评估共培养对骨细胞分化的影响。研究发现，当RAW264.7细胞、BMSC与FLS三者共培养时，与单独培养或两两共培养相比，出现了功能上的相互影响：RANKL刺激的RAW264.7细胞的破骨活性（Trap阳性细胞数）增强，而成骨诱导的BMSC的成骨分化活性（Alp阳性细胞数）却受到抑制。这一结果直观地模拟了RA关节中存在的“骨平衡”破坏——即破骨细胞活性增强而成骨细胞功能受损，共同导致了净骨丢失（骨侵蚀）。
药物效应验证：使用雷公藤红素进行验证性实验。结果显示，在共培养模型中，雷公藤红素（500 ng/mL）能够有效抑制FLS向骨相关细胞区域的迁移。同时，该处理也下调了FLS中Cadherin-11的表达。此外，雷公藤红素还显著降低了共培养体系中破骨细胞（RAW264.7细胞）的Trap活性。这些发现与该药物已知的体内抗RA作用（抑制滑膜炎症和骨侵蚀）相一致，证明了该微流控模型能够同步评估药物对FLS迁移和骨细胞功能的复合影响。
四、 研究结论与意义 本研究成功开发并验证了一种基于微流控芯片的FLS与破骨细胞、成骨细胞前体细胞共培养模型。该模型能够有效地模拟RA病理过程中FLS迁移侵袭介导的骨侵蚀这一关键环节。研究证实，FLS的迁移行为受其周围骨细胞类型的影响，破骨细胞的存在会增强FLS的迁移能力和侵袭相关蛋白Cadherin-11的表达。同时，FLS的存在也会反过来影响骨微环境，促进破骨活性并抑制成骨活性，从而在体外重现了导致骨侵蚀的细胞间“恶性对话”。利用该模型对雷公藤红素的测试结果，与体内药效吻合，表明该平台可用于抗RA药物的体外筛选和机制研究。
本研究的科学价值在于提供了一个高度仿生、可实时观察、且能整合多细胞类型相互作用的体外研究工具，克服了传统静态培养模型的局限性。其应用价值主要体现在为RA病理机制研究，特别是FLS与骨细胞互作机制，提供了一个新颖的实验平台；同时，也为开发以抑制FLS迁移和骨侵蚀为靶点的新型抗RA药物，建立了一个高效、可靠的体外筛选和评价模型。
五、 研究亮点 1. 模型创新性：首次在微流控芯片上构建了包含FLS、破骨细胞前体和成骨细胞前体的三重细胞共培养体系，并利用Matrigel通道模拟细胞外基质屏障，更真实地模拟了RA关节中滑膜组织与骨组织交界处的复杂微环境及细胞迁移过程。 2. 功能整合评估：该模型不仅能评估FLS的迁移行为，还能同步检测破骨细胞和成骨细胞的功能活性变化，实现了对“FLS迁移-骨侵蚀”这一病理链条的多终点、一体化分析。 3. 动态与高通量潜力：微流控技术允许连续灌注和实时显微观察，便于研究细胞行为的动态过程。芯片设计包含多个平行单元，具备发展为中高通量药物筛选平台的潜力。 4. 转化应用明确：研究直接使用临床相关细胞系和原代细胞，并成功用已知抗RA药物验证了模型的有效性，证明了其用于药物发现和评价的实用价值。 5. 机制关联发现：研究将FLS的迁移表型与Cadherin-11的表达联系起来，并在共培养背景下观察到了骨形成与骨吸收平衡的破坏，为理解RA骨侵蚀的细胞分子机制提供了新的线索和数据。
六、 其他有价值的内容 研究团队在讨论部分深入分析了其发现与现有知识的关联。例如，他们指出FLS与破骨细胞共培养时迁移增强，可能与破骨细胞产生多种细胞因子和趋化因子有关；而Cadherin-11在迁移FLS中高表达，进一步支持了其在RA滑膜侵袭中的作用。此外，他们对比了本研究结果与既往使用传统方法（如伤口愈合实验）的差异，凸显了微流控模型在模拟细胞间通讯和空间复杂性方面的优势。最后，作者也指出了模型的局限性，如尚未引入免疫细胞（这在RA炎症中至关重要），以及未来需要进一步探索FLS与骨细胞相互作用的分子机制，为后续研究指明了方向。