本研究由 Lucas Silva Abreu、Yuri Mangueira do Nascimento、Rafael dos Santos Costa 等学者合作完成，主要作者隶属于巴西帕拉伊巴联邦大学药物与医药研究所、巴伊亚联邦大学药学院与生物研究所、奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会病毒学系以及里约热内卢联邦农村大学化学研究所等机构。该研究论文发表在 Journal of Natural Products 上，于2019年3月19日收稿，文献DOI为10.1021/acs.jnatprod.9b00251。本研究属于天然产物化学与抗病毒药物发现领域，旨在对巴西植物 Stillingia loranthacea 根皮中的萜类化合物进行系统的植物化学分析，并评价所分离化合物对寨卡病毒（ZIKV）复制的抑制活性。
Stillingia 属是大戟科一个包含约30个物种的植物属，此前已从该属少数物种中分离得到齐墩果烷型、蒲公英烷型三萜以及巴豆烷型、达芙烷型二萜，部分化合物表现出抗病毒和细胞毒活性。寨卡病毒自2015年在巴西大规模暴发以来，与新生儿发育缺陷、吉兰-巴雷综合征等严重神经系统并发症密切相关，急需开发有效的抗病毒药物。天然产物因结构多样性和生物活性多样性，成为抗病毒先导化合物发现的重要来源。因此，本研究的科学目标在于：利用现代分析化学与分子网络技术，从 S. loranthacea 根皮中快速发现并定向分离28-去甲蒲公英烷型三萜，系统分离并鉴定巴豆烷型和柔性烯型二萜，进一步评价其在 Vero 细胞中的细胞毒性和抗寨卡病毒活性，为开发新型 ZIKV 抑制剂提供物质基础和构效关系线索。
研究的实验流程包括植物材料处理、提取分离、基于分子网络的定向分离、结构鉴定、细胞毒性评价以及抗病毒活性评价。植物材料采自巴西巴伊亚州 Morro do Chapéu，根皮经干燥后用正己烷浸提，得到正己烷提取物。部分提取物通过硅胶柱色谱和制备型高效液相色谱进行分离，利用质谱、一维与二维核磁共振谱以及高分辨质谱确定化合物结构。通过经典分离方法获得化合物1、2、5、6、8、9、10、11、13、14以及2和7的混合物，再经等度制备型 HPLC 分离得到2和7。与此同时，研究团队还通过液相色谱-电喷雾串联质谱获取四类植物器官（根皮、根心材、茎、叶）正己烷提取物的二级质谱数据，利用全球天然产物社会分子网络平台进行分子网络聚类分析，以化合物1和2作为“种子”节点识别出与28-去甲蒲公英烷骨架相关的A簇。该簇中除已分离化合物外，还包含m/z 603、555、527、513、499、427和469等若干节点，提示存在新的同骨架化合物。据此导向，研究者通过 LC-ESIMS2 目标分离策略成功获得化合物3和4。该分子网络方法还揭示B簇和C簇分别对应柔性烯型二萜和巴豆烷型二萜。在结构鉴定中，化合物1—8为新化合物，命名为loranthones A—D以及12-deoxyphorbol-13-(Z)-5-tetradecanoate等；化合物9—14为已知化合物。结构解析中除常规波谱外，还采用密度泛函理论计算的13C核磁共振谱支持了化合物1中δ14双键位置的判断，该计算流程使用Spartan程序进行构象搜索和优化，以EDF2/6-311G*水平计算最低能量结构，再用Boltzmann权重生成化学位移数据。在生物活性评价中，研究者使用 Vero 非洲绿猴肾细胞，通过 MTT 法测定各化合物的20%细胞毒浓度和50%细胞毒浓度，并以6-甲基巯基嘌呤核苷作为阳性对照；抗病毒评价采用巴西流行的 ZIKV PE243 株，以感染复数0.1感染 Vero 细胞后，用各化合物在其20%细胞毒浓度下处理5天，通过半数组织培养感染剂量法进行病毒滴定。统计分析采用单因素方差分析和 Dunnett 检验，P<0.05视为有统计学意义。
研究结果显示，化合物1、2和5—14对 Vero 细胞的20%细胞毒浓度范围为8.7至328 μM，50%细胞毒浓度范围为24.6至848 μM，提示这些化合物对上皮细胞毒性较低。抗病毒实验中，未处理组的 ZIKV 滴度达到6.7 log10 TCID50/ml，阳性对照6MMPR处理后降至5.4 log10 TCID50/ml。12个受试化合物中，化合物2、5、9、10、11和14显著降低了 ZIKV 复制水平。其中化合物2和5最具抗病毒潜力，分别使病毒滴度降低1.7和1.8 log10 TCID50/ml，其作用强度与已知合成抑制剂及部分植物来源天然产物相当。构效关系分析表明，在巴豆烷型二萜中，仅 C-20位具有羟基的化合物（5、9、10、11）表现出抗病毒活性，而 C-20位为甲酰基的化合物（6、7、8）丧失活性，提示C-20羟基对抗 ZIKV 活性至关重要。分子网络的结果也成功导向了化合物3和4的定向分离，二者分别为3α-hexanoyl-28-nor-D-friedoolean-14-en-16-one-23-oic acid和3α-butanoyl-28-nor-D-friedoolean-14-en-16-one-23-oic acid，表明基于LC-MS/MS分子网络的去重复化策略在稀有萜类发现中具有显著优势。化合物1和2作为28-去甲蒲公英烷型三萜，分子结构中具有14位双键、16位酮基和17位去甲基等特征，其质谱碎片m/z 439、393和205的规律也为后续同类化合物的快速指认提供了数据支撑。
本研究首次对 Stillingia loranthacea 进行了植物化学分析，发现了两个新的28-去甲蒲公英烷型三萜（化合物1、2），并通过分子网络导向进一步分离得到另外两个同骨架新化合物（化合物3、4）；同时获得了四个新的巴豆烷型二萜（化合物5—8）以及三个已知巴豆烷型二萜和三个已知柔性烯型二萜。研究证实 S. loranthacea 根皮中的萜类化合物是有效的 ZIKV 复制抑制剂，尤其是化合物2和5具有作为先导化合物进行后续开发的潜力。该工作的科学价值在于拓展了 Stillingia 属植物的化学多样性与抗病毒活性认知，方法学上将分子网络与定向分离相结合，提高了微量或难分离天然产物的发现效率；应用价值上，为寨卡病毒治疗药物的开发提供了新的天然产物先导物和初步构效关系依据，也为后续动物模型评价和结构优化奠定了基础。
本研究的亮点包括：首次报道了源自 S. loranthacea 的28-去甲蒲公英烷型三萜及系列巴豆烷型二萜；以分子网络和质谱碎片相似性策略实现了复杂提取物中稀有骨架化合物的快速指认和目标分离；系统评价了化合物对 ZIKV 巴西流行株的抗病毒活性并初步揭示C-20羟基对巴豆烷型二萜抗 ZIKV 活性的重要性。此外，化合物1—4作为自然界中极罕见的28-去甲蒲公英烷型三萜，此前仅在大戟科一个物种中有过报道，其发现进一步丰富了该骨架的天然产物化学空间。