类型b

这篇综述文章由Kejin Hu撰写，来自阿拉巴马大学伯明翰分校干细胞研究所生物化学与分子遗传学系，发表于《Stem Cells and Development》2014年第23卷第12期。

文章主要探讨了诱导多能干细胞（iPSC）重编程过程中的载体学和因子递送系统。作者详细介绍了当前重编程协议中使用的各种技术及其优缺点。

首先，作者回顾了逆转录病毒载体在iPSC重编程中的应用。这类载体虽然能够提供相对长期的转基因表达，但存在插入突变、不受控制的沉默、残余表达和转基因再激活以及免疫原性等问题。为了解决这些问题，研究者探索了多种新技术，包括腺病毒载体、蛋白质转导、RNA转染、微环DNA、可切除的piggyBac转座子、Cre-lox切除系统、负链RNA复制子、正链RNA复制子、基于Epstein-Barr病毒的游离质粒以及反复转染质粒等。

接下来，作者详细讨论了慢病毒载体（Lentiviral vector）。这类载体来源于HIV-1，具有复杂结构，包含额外的调控蛋白和辅助蛋白。慢病毒载体可以转导不分裂和缓慢分裂的细胞，这在重编程过程中是一个优势，因为体细胞干细胞通常是更好的起始细胞，但它们通常生长缓慢或处于静止状态。为了提高安全性，开发慢病毒载体时采取了多种措施，如删除所有病毒编码基因、使用非病毒异源启动子等。

然后，文章介绍了微环DNA（Minicircle DNA）。由于其游离性质和较低程度的载体沉默，微环DNA被用于建立无足迹的iPSC系。微环是指不含细菌骨架的超螺旋环状DNA，通过细菌宿主中的可控、诱导型分子内位点特异性重组生成。微环DNA一般不复制，但也有报道发现复制型微环。

此外，蛋白质转导技术也被应用于递送外源蛋白到培养的细胞或活体组织中。这种技术利用蛋白质转导域（PTD，也称为细胞穿透肽，CPP）介导蛋白质转导。PTD天然存在于许多蛋白质中，如HIV1转录激活因子Tat、单纯疱疹病毒1型结构蛋白VP22和果蝇转录因子Antennapedia（Antp）。PTD介导的蛋白质转导可以在许多不同类型的细胞中进行，包括难以转染的神经细胞，并且可以将大蛋白质递送到活体动物的所有组织中，包括大脑，表明其具有穿越血脑屏障的能力。

Sendai病毒载体（SeVVs）是另一种重要的非整合型载体。Sendai病毒是一种包膜、不分节段、单链、负义RNA病毒，属于副粘病毒科。SeVVs以核糖核蛋白（RNP）形式在宿主细胞胞质中复制和转录，无需经过DNA阶段。这种能力确保了重编程因子在转导细胞中的持久表达，从而实现完全重编程。

RNA转染技术可以直接将RNA递送到培养的细胞或动物体内，作为DNA和蛋白质的替代品。与DNA递送相比，mRNA的目的地是细胞质而非细胞核，因此更多的遗传信息可以更快地到达目标位点，因为消除了核内化效率低下的障碍。mRNA几乎可以立即翻译，而DNA需要额外的转录步骤。然而，mRNA转染有两个主要缺点：一是RNA的半衰期短，递送的mRNA表达更为短暂，限制了其在长时间过程如重编程中的应用；二是RNA比DNA更具免疫原性，会引起强烈的先天免疫反应，从而在重编程过程中引入并发症。

基于Epstein-Barr病毒（EBV）的游离载体广泛应用于重编程。这类载体可以在灵长类细胞中复制和分配，其复制依赖于病毒来源的顺式元件OriP和反式作用因子EBNA1。EBV载体可以容纳较大的DNA片段，主要在灵长类细胞中工作，据报道不会在啮齿类细胞中持续存在。

2A肽和IRES是构建多顺反子载体的两种流行手段。2A肽是一种短肽（18-22个氨基酸），可以从单一开放阅读框（ORF）中共表达两个蛋白质。2A肽介导的转基因共表达因其小尺寸、效率、化学计量和各种功能变体的可用性而受到欢迎。相比之下，IRES是一段约450个核苷酸的高度结构化RNA，指导下游编码RNA的帽子非依赖性蛋白质合成起始。

最后，文章讨论了piggyBac转座子和载体。piggyBac是一种从甘蓝夜蛾中分离出来的非病毒2,472 bp DNA转座子，可以在广泛的宿主基因组中转座。piggyBac转座子由3’和5’末端重复结构域（TRDs）和一个编码piggyBac转座酶的ORF组成。piggyBac转座遵循“剪切-粘贴”机制，转座子盒在TTAA位点整合到基因组中。

这篇文章全面总结了当前iPSC重编程中使用的各种载体学和因子递送系统，提供了丰富的背景知识和技术细节，对于研究人员选择合适的重编程方法具有重要参考价值。文章强调了每种技术的优缺点，并指出了未来可能的研究方向，旨在开发更高效、更安全、非整合的重编程方法。