近日，由武汉大学人民医院临床检验中心王明、童永清、李艳教授团队，武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室付爱思、胡奔、刘然、邓子新、刘天罡教授团队，以及中国科学院上海营养与健康研究所计算生物学重点实验室刘震、向彬、魏武教授团队等共同完成的一项关于新冠病毒检测新技术的突破性研究，在学术期刊 *Small*（2020年，第16卷，文章编号 2002169）上以开放获取形式发表。这项研究开发并验证了一种名为“纳米孔靶向测序”（Nanopore Targeted Sequencing, NTS）的新型诊断方法，旨在实现对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2，即新冠病毒）及其他呼吸道病毒进行快速、准确且全面的检测。
本研究的学术背景聚焦于分子诊断学与临床病毒学领域，特别是针对全球大流行的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。研究的出发点是解决当时主流诊断方法——实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）所面临的挑战。尽管RT-qPCR被公认为COVID-19核酸诊断的“金标准”，但在临床应用中存在较高的假阴性率，且无法识别其他可能导致相似症状的呼吸道病毒感染，这增加了患者误诊、延误隔离以及交叉感染的风险。同时，现有方法难以实时监测病毒的基因序列变异，而这对于流行病学调查、病毒分型及毒力评估至关重要。此外，一些新兴的检测方法（如基于CRISPR的技术）虽然快速，但对特定RNA靶标区域的依赖使其易受病毒突变（如新加坡报道的382个核苷酸缺失事件）影响，导致检测失败。在此背景下，研究团队旨在开发一种能够结合靶向扩增的高灵敏度与纳米孔长读长、实时测序优势的技术，以实现对SARS-CoV-2及其共存呼吸道病毒的同步、精准鉴定，并为病毒突变监控提供数据支持。
研究的技术流程设计精巧，主要包含以下几个核心环节：
第一，靶标区域与引物面板设计。 这是NTS方法特异性和全面性的基础。针对SARS-CoV-2，研究团队没有局限于中国或美国疾控中心（CDC）推荐的RT-qPCR检测位点（通常为1-3个），而是重点关注了与病毒毒力和感染相关的基因组区域。具体而言，他们选择了覆盖病毒基因组中编码刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）以及多个开放阅读框（ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8, ORF10）的11个毒力相关基因片段（每个片段600-950 bp），外加编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）的ORF1ab基因上的特定区域，共计12个靶标片段进行扩增。为此，他们设计了26条特异性引物，构成了SARS-CoV-2引物面板。设计时考虑了引物间的相互作用、退火温度，并排除了与人、常见细菌和真菌基因组的非特异性结合。为应对潜在的低病毒载量或靶点突变，ORF1ab区域采用了两对引物进行嵌套式扩增。同样，为了扩展检测范围，研究团队还设计了一个针对10种常见呼吸道病毒（如甲/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等）的呼吸道病毒引物面板，包含20个靶标区域和59条引物。
第二，NTS实验流程。 整个检测流程总时长控制在6-10小时，具体步骤如下：1) 样本处理：从咽拭子样本中提取总核酸（包括RNA和DNA）。2) 逆转录：将总RNA逆转录为cDNA。3) 多重PCR靶向扩增：对于每个样本，使用SARS-CoV-2引物面板和呼吸道病毒引物面板（分两个反应管）分别对cDNA（RNA病毒）和总核酸中的DNA（DNA病毒）进行多重PCR扩增，一次性获得所有靶标片段。4) 条形码添加与文库构建：将同一份样本的两种PCR产物合并，通过条形码PCR或商业连接酶方法，为每个样本的扩增产物加上独特的测序条形码，实现多个样本的混合测序。5) 纳米孔测序：将带条形码的混合文库加载到牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）的MinION或GridION测序芯片上进行测序。6) 实时数据分析：利用团队自研的生物信息学流程，在测序进行过程中（如开始后10分钟、1小时、4小时）实时分析产出数据。该流程首先进行碱基识别和质量过滤，然后通过条形码拆分成单样本数据。关键的一步是使用BLASTN工具，将测序序列比对到包含所有病毒基因组的数据库中，筛选出与目标病毒基因组相似度>90%的高可信度序列。数据分析的核心是“NTS评分系统”，该团队为结果的判读制定了量化的评分规则。他们统计每个靶标区域能比对上的有效序列数，并与阴性对照进行比较。每个靶标的得分根据比值（样本有效读数/阴性对照有效读数）分为：比值≥10得1分（阳性），3≤比值<10得0.4分（可疑），比值<3得0分（阴性）。所有12个靶标的得分之和为NTS总分。总分>2.4判为SARS-CoV-2阳性，1.2-2.4为高度可疑，<1.2为阴性。
第三，性能验证与临床应用。 研究通过多层次的实验系统评估了NTS的性能。首先是灵敏度与检测限（LoD）：使用含有新冠病毒S和N基因的标准质粒模拟病毒，将其稀释为0至3000拷贝/反应的梯度浓度并加入背景核酸中进行测试。结果显示，测序1小时后，10拷贝/反应的质粒即可在3/4的重复中被可靠检测（即LoD为10拷贝/反应）。这证明了NTS对低病毒载量样本的高灵敏度。其次是特异性：使用已知感染其他五种常见呼吸道病毒（流感病毒、副流感病毒等）的临床样本进行测试，NTS的SARS-CoV-2引物面板未产生任何交叉反应，特异性达到100%。理论分析也表明，设计的引物与其他人类冠状病毒（如SARS、MERS）基因组匹配度低，不会导致误判。
最重要的验证环节是临床样本的平行检测。研究团队收集了来自武汉一线医院的61份核酸样本进行NTS与已获批准上市的RT-qPCR试剂盒的“头对头”比较。这些样本分为两组：第一组为45份疫情早期疑似门诊患者样本，第二组为16份已通过临床综合诊断确诊的住院患者样本。结果显示： 1. 在45份疑似样本中，RT-qPCR判定19份阳性、15份可疑、11份阴性。而NTS则鉴定出34份阳性，比RT-qPCR多出15份阳性结果，其中包括11份RT-qPCR判为可疑的样本和4份RT-qPCR判为阴性的样本。 2. 在16份确诊患者样本中，RT-qPCR仅检出9份阳性，而NTS则成功检出全部16份阳性。 这项对比有力地证明了，对于病毒载量较低或核酸质量不佳的样本，NTS比传统RT-qPCR具有更高的检出能力，能有效降低假阴性风险。此外，在测序开始后仅10分钟，NTS就能从部分高病毒载量样本中快速获得阳性信号，展现了其快速筛查的潜力。
第四，病毒突变分析与分型能力展示。 NTS的另一个核心优势在于其不仅能检测病毒是否存在，还能提供病毒的基因序列信息。研究团队对NTS检出的50份阳性样本的测序数据进行了深入分析。使用纳米孔公司开发的Medaka变异识别软件，他们在27份样本中共发现了42个单核苷酸突变位点，其中包括28个非同义突变。特别值得关注的是位于基因组第28144位点的T>C突变（导致亮氨酸变为丝氨酸），该突变在8份样本中出现。根据此前的研究，此位点是区分SARS-CoV-2两种主要类型——L型和S型——的关键标志。基于此，研究团队对31份数据覆盖度足够的样本进行了分型，结果显示71.0%（22份）为L型，25.8%（8份）为S型，这与疫情早期武汉地区L型毒株占主导的流行病学发现相一致。此外，研究还对检测到的突变进行了全基因组等位基因频率分析和连锁不平衡（LD）分析，为进一步的分子流行病学研究提供了数据支持。
第五，多病原体共感染检测验证。 为了测试NTS同时检测多种呼吸道病毒的能力，研究团队将5种不同呼吸道病毒阳性样本混合成模拟病毒群落，并使用呼吸道病毒引物面板进行NTS检测。结果证实，NTS能在一次检测中成功鉴别出其中至少4种病毒。更重要的是，在对13份临床样本同时应用SARS-CoV-2和呼吸道病毒两个引物面板的NTS检测中，成功发现了一例新冠病毒与甲型流感病毒H3N2亚型的共感染病例。这凸显了NTS在复杂呼吸道感染鉴别诊断中的独特价值。
本研究得出以下核心结论：研究团队成功开发了一种基于纳米孔靶向测序（NTS）的创新诊断平台。该平台能够在6-10小时内，以高灵敏度（LoD为10拷贝）和高特异性（SARS-CoV-2检测特异性达100%），对SARS-CoV-2及其他常见呼吸道病毒进行同步、全面检测。与主流RT-qPCR方法相比，NTS在临床样本中展现出更高的阳性检出率，尤其适用于低病毒载量或RT-qPCR结果可疑的样本。此外，NTS能够直接获取病毒关键基因区的序列信息，实现病毒突变实时监控、基因分型以及共感染病原体鉴定。
本研究的科学价值与应用价值显著。其科学价值在于，它将靶向扩增的高富集效率与纳米孔测序的长读长、实时分析优势有机结合，为分子诊断学提供了一个兼具“发现”（测序的广谱性）与“确认”（靶向的特异性）能力的新范式。在应用层面，NTS为解决COVID-19临床诊断中的假阴性难题提供了强有力的补充工具，有助于更早、更准地识别和隔离感染者，切断传播链。其共感染检测功能可优化临床治疗决策，避免因漏诊其他病原体而延误治疗。同时，该方法产出的序列数据为病毒溯源、演化追踪、毒力突变研究等公共卫生应对措施提供了即时、宝贵的数据源，将一次性的诊断检测升级为兼具监测功能的“诊断-监测”一体化方案。
本研究的亮点可归纳为以下几点：1. 方法学的创新性：首次将针对新冠病毒毒力基因的、覆盖多个片段的靶向多重PCR，与实时纳米孔测序及配套的自动化分析流程深度融合，创建了完整的NTS诊断方案。2. 性能的优越性：通过严格的实验验证和临床平行对照，证实了NTS在灵敏度、特异性以及阳性检出率上相较RT-qPCR的优势。3. 功能的全面性：不仅实现单病原体检测，更拓展至多病原体共感染诊断和病毒基因组学分析，一“测”多能。4. 应用的即时性：6-10小时的周转时间虽略长于RT-qPCR，但远快于传统的宏基因组或全基因组测序方法，使其具备了临床实用的潜力，尤其适用于需要精确鉴别诊断和流行病学溯源的重点病例或聚集性疫情。5. 评分系统的客观性：开发了一套基于多靶标序列覆盖度的量化评分规则，减少了主观判读误差，提高了结果的可重复性和标准化程度。
研究团队也客观指出了NTS的当前局限，如操作比RT-qPCR复杂、周转时间稍长。他们认为，NTS与RT-qPCR应是互补关系：RT-qPCR用于大规模快速初筛，而NTS则作为对初筛阴性/可疑样本、重症或疑难病例、以及需要监测病毒变异的重点人群的精确验证和深入分析手段。展望未来，通过开发自动化操作系统、集成微流控芯片、并利用云端分析平台，有望进一步简化操作、降低成本、提高通量，使NTS技术在未来应对新发突发传染病疫情中发挥更大的作用。