本文属于类型a，即针对单篇原创性研究的学术报告。以下为详细内容：
作者及机构
本研究由Vanderbilt大学团队的Justin A. Avila（共同第一作者）、Joseph T. Benthal（共同第一作者）、Jenny C. Schafer、David K. Flaherty及通讯作者E. Michelle Southard-Smith共同完成，作者单位包括Vanderbilt Brain Institute、Program in Human Genetics、Department of Cell and Developmental Biology等。研究成果发表于《Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology》期刊，发表日期为2025年8月6日（DOI: 10.1016/j.jcmgh.2025.101590）。
学术背景
研究领域与科学问题
本研究聚焦于肠道神经系统（Enteric Nervous System, ENS）的发育机制，重点探究转录因子Sox10在ENS神经元亚型分化中的作用。ENS是调控胃肠运动的关键神经网络，其发育异常会导致先天性巨结肠症（Hirschsprung Disease, HSCR）。此前研究发现，Sox10缺陷虽可解释HSCR的神经节缺失表型，但其如何影响神经元亚型比例仍不清楚。
研究目标
本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，揭示Sox10缺陷小鼠（Sox10dom/+）ENS发育过程中神经元轨迹分配的改变，并筛选关键调控基因，尤其是Hox基因家族的候选成员。
研究流程与实验设计
1. 样本制备与数据生成
- 研究对象：Sox10dom/+突变小鼠及其野生型（Sox10+/+）同窝对照，胎龄15.5天（dpc）的肠道组织。
- 转基因工具：结合Sox10-YFP（标记ENS前体细胞和胶质细胞）与Phox2b-CFP（标记神经元）双荧光报告系统，通过流式分选（FACS）分离ENS细胞（野生型4例，突变型3例）。
- 测序策略：采用10x Genomics单细胞测序平台，目标测序深度为60,000 reads/细胞，实际平均达105,000 reads/细胞，显著高于常规标准（30,000 reads/细胞），以提升低表达转录因子的检出率。
2. 数据分析流程
- 数据预处理：使用Cell Ranger和SoupX去除环境RNA污染，Seurat v4.1.1进行批次校正与整合。
- 细胞分群与注释：通过UMAP降维和Louvain聚类，鉴定19个亚群（11,132个细胞），包括前体细胞（PC）、神经元（NC）和过渡态细胞；基因本体（GO）富集分析确认细胞类型特征。
- 创新性分析：
- 轨迹推断：Scvelo算法揭示3条神经元分化轨迹（Branch A/B/C）及2条过渡路径（Path1/Path2）。
- 基因调控网络（GRN）：利用SCENIC分析预测Hox基因（如Hoxa6）的调控活性。
- 跨数据集验证：与已发表的Morarach et al. (2021) ENS单细胞数据整合，通过Harmony校正验证结果一致性。
3. 实验验证
- 免疫组化（IHC）：证实Sox10蛋白在早期分化神经元（HUC/D+细胞）中的表达。
- 杂交链式反应（HCR）：定量验证Hoxa6 mRNA在Sox10dom/+突变体中表达降低（p = 1.46e-08）。
主要研究结果
1. Sox10在早期神经元分化中的角色
- Sox10蛋白定位：在13.5 dpc肠道中，Sox10与神经元标志物HUC/D共定位，提示其直接参与神经元早期分化（图1A）。
2. 神经元轨迹的复杂性
- 三类轨迹的发现：相比前人报告的2条轨迹，本研究通过深度测序在15.5 dpc鉴定出3条分化轨迹（Branch A/B/C），其中Branch B和C分别对应成熟ENS的兴奋性神经元和抑制性神经元（图3）。
- Hox基因的调控作用：SCENIC分析显示，野生型中9个Hox基因（如Hoxa6、Hoxb8）的GRN活性在神经元分化中显著增强，而突变体中Hoxa6表达下调（图11）。
3. Sox10dom/+突变的影响
- 细胞比例改变：突变体的Branch C神经元数量减少（p = 0.014），Branch B增加（p = 0.0137），且过渡态细胞（Path2）减少（图7）。
- 分化速率降低：Scvelo分析显示突变体的细胞状态转换速率显著下降（图9E）。
4. Hoxa6的关键地位
- 候选调控因子：Hoxa6在野生型Branch C中高表达，突变体中其表达降低（图12A）；HCR证实Hoxa6/Elavl4信号比在突变体肠道中下降（p = 4.82e-23）。
- 机制假说：Sox10可能通过直接结合Hoxa6启动子（保守结合位点预测）调控其表达（补充表20）。
结论与意义
科学价值
- 理论突破：首次证实Sox10通过调控Hox基因（尤其是Hoxa6）影响ENS神经元亚型分化，填补了ENS发育调控网络的空白。
- 方法创新：深度单细胞测序技术将神经元轨迹分辨率从2条提升至3条，为发育生物学研究提供新范式。
应用前景
- 疾病治疗：Hoxa6可作为靶点，用于定向分化ENS神经元，治疗HSCR术后的胃肠动力障碍。
- 干细胞工程：研究为体外生成特定ENS神经元亚型提供了分子路线图。
研究亮点
- 深度测序的优势：通过超高测序深度（105,000 reads/细胞）首次在15.5 dpc解析ENS三类神经元轨迹。
- Hox基因的调控网络：发现Hox基因簇在ENS分化中的系统性作用，突破了既往仅关注单个转录因子（如Phox2b）的局限。
- 跨学科技术整合：结合scRNA-seq、HCR原位验证与计算生物学（SCENIC/Scvelo），形成多维度证据链。
其他发现
- 潜在临床关联：Sox10dom/+突变体与HSCR患者均表现出近端肠神经元比例异常，提示研究结果可能指导临床分型。
- 技术启示：该研究策略可推广至其他复杂器官系统的发育机制研究。
（全文约2000字）