本研究于2017年发表在《Journal of Virology》期刊上，标题为“Structural transitions of the conserved and metastable hantaviral glycoprotein envelope”。文章的第一作者是Ilona Rissanen，通讯作者是Thomas A. Bowden。研究团队主要来自英国牛津大学威康信托人类遗传学中心结构生物学部（Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford），合作者还包括瑞士苏黎世大学（University of Zürich）、芬兰赫尔辛基大学（University of Helsinki）以及芬兰兽医病理学研究所（Institute of Veterinary Pathology）的研究人员。
本研究属于病毒学与结构生物学交叉领域，聚焦于汉坦病毒（Hantavirus）。汉坦病毒是一种布尼亚病毒目（Bunyavirales）的负链RNA病毒，通过啮齿动物传播给人类，可引发两种严重疾病：肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome, HCPS），死亡率分别可达12%和40%。病毒表面包裹着一层脂质包膜，其上镶嵌着由两种糖蛋白Gn和Gc构成的尖峰复合体。这些糖蛋白在宿主细胞识别和入侵过程中起着关键作用，同时也是中和抗体的主要靶标。
在病毒进入细胞的过程中，汉坦病毒通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，并在酸性环境下（晚期内吞体/溶酶体）触发Gc介导的病毒膜与宿主细胞膜的融合。尽管Gc蛋白（具有II类融合蛋白折叠构象）的pH依赖性构象变化已被部分阐明，但由Gn和Gc共同构成的整个糖蛋白晶格在酸性环境下的动态变化过程尚不清楚。之前的研究已获得了普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）和汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）Gc蛋白的结构，以及PUUV Gn蛋白的结构。然而，作为最重要、分布最广的致病性汉坦病毒之一，HTNV的Gn蛋白结构仍然未知。本研究旨在解析HTNV Gn蛋白的结构，并将其与PUUV Gn结构进行比较，以探究汉坦病毒Gn蛋白结构的保守性；更重要的是，研究Gn蛋白以及整个Gn-Gc糖蛋白晶格在pH变化下的动态行为，从而在分子层面揭示汉坦病毒包膜在细胞入侵过程中的结构转变机制。
本研究是一个综合运用了X射线晶体学、生物化学和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）的多学科研究。其工作流程可以分为四个主要部分：
1. HTNV Gn蛋白的表达、纯化与晶体结构解析 * 研究目标：获得HTNV Gn蛋白胞外域的高分辨率三维结构。 * 实验对象与方法：研究构建了编码HTNV Gn蛋白胞外域（残基18-371）的哺乳动物表达载体，并在HEK 293T细胞中进行瞬时表达。为了提高结晶成功率，在表达过程中使用了甘露糖苷酶抑制剂（Kifunensine），并在蛋白纯化后使用内切糖苷酶F1（Endo F1）对糖链进行了修剪。 * 蛋白质纯化：从细胞上清液中通过切向流过滤浓缩、固定化金属亲和层析和尺寸排阻色谱法纯化获得高纯度的Gn蛋白。 * 晶体生长与数据收集：将纯化并去糖基化的Gn蛋白在酸性条件（pH 4.0）下进行结晶，使用坐滴气相扩散法获得了晶体。X射线衍射数据在英国钻石光源同步辐射装置的I04光束线上收集。 * 结构解析与精修：使用分子置换法，以已知的PUUV Gn结构作为搜索模型，解析了HTNV Gn的结构。随后利用Phenix、Coot等软件进行迭代的精修和模型构建，最终获得了分辨率为2.15 Å的原子结构。分析内容包括整体结构描述、与PUUV Gn的结构叠加比较（计算均方根偏差，RMSD），以及将该结构拟合到先前发表的图拉病毒（Tula virus, TULV）的冷冻电镜重构密度图中，以确定其在病毒表面的位置。
2. 溶液中Gn蛋白的pH依赖性寡聚化状态分析 * 研究目标：验证晶体结构中观察到的Gn蛋白寡聚体（尤其是酸性四聚体）在溶液中是否真实存在，并探究pH对Gn蛋白寡聚状态的影响。 * 实验对象与方法：使用分析型超速离心（Analytical Ultracentrifugation, AUC）技术。 * 样品处理：将纯化的HTNV Gn蛋白分别置于中性（pH 7.0）和酸性（pH 4.5）缓冲液中进行透析交换。 * 实验运行与数据分析：在不同pH条件下进行沉降速度实验，记录蛋白质的沉降系数分布。使用Sedfit软件中的c(s)和c(s, f/f0)模型分析数据，确定溶液中存在的寡聚体种类（单体、二聚体、三聚体、四聚体等）及其比例。同时，根据晶体结构计算了不同寡聚体状态的理论沉降系数，与实验结果进行对比验证。
3. 全病毒颗粒在酸性条件下糖蛋白晶格变化的观察 * 研究目标：在接近生理环境的全病毒颗粒水平上，直接观察酸性pH对整个病毒包膜Gn-Gc糖蛋白晶格结构的影响。 * 实验对象：非致病性的图拉病毒（Tula virus, TULV）作为模型病毒。 * 病毒制备：在Vero E6细胞中培养TULV，通过超速离心密度梯度纯化获得高纯度的病毒颗粒。 * 冷冻电镜样品制备与成像：将纯化的TULV病毒颗粒分别用中性（pH 7.0）和酸性（pH 5.0）缓冲液处理，然后快速冷冻制备成冷冻电镜样品。使用配备直接电子探测器和能量过滤器的透射电镜进行成像。通过MotionCor2软件校正光束引起的运动，使用CTFFIND4估算衬度传递函数参数。 * 图像分析：从大量病毒颗粒图像中挑选出颗粒投影，进行二维分类平均。通过对比分析pH 7.0和pH 5.0条件下病毒颗粒表面的二维平均图像，以及垂直于膜方向的平均密度分布图，直观地揭示了糖蛋白晶格的规则性变化。
4. 结构模型构建与整合分析 * 研究目标：整合晶体结构、溶液分析和全病毒观察的结果，提出一个关于汉坦病毒在宿主细胞入侵过程中包膜糖蛋白重排的分子模型。 * 方法：研究人员将HTNV Gn的酸性四聚体晶体结构、已发表的HTNV Gc三聚体晶体结构，以及TULV的冷冻电镜重构结果相结合，通过逻辑推理和模型构建，描绘了从病毒表面稳定状态到酸性诱导的Gn-Gc晶格解离，再到Gc融合环暴露并发生构象变化以介导膜融合的整个过程。
1. HTNV Gn蛋白的晶体结构揭示了其高度保守的折叠构象。 * 结构描述：HTNV Gn胞外域（残基18-371）呈现为一个由五个反平行β片层和六个α螺旋组成的混合型α/β三明治折叠（α/β-sandwich fold），并由七个二硫键稳定。该结构与PUUV Gn结构高度相似，叠加315个Cα原子后的RMSD仅为1.3 Å。尽管两者氨基酸序列一致性仅为44%，相似性为64%，但核心折叠构象高度保守，证实了汉坦病毒属内Gn蛋白折叠结构的普遍保守性。 * 结构比对与定位：结构比对显示，大部分区域的结构差异很小，但在两个区域存在无序或柔性（残基190-197和281-289）。将HTNV Gn结构拟合到TULV的冷冻电镜重构图中，发现其最佳定位区域是病毒包膜最外层的球状密度，这与之前对PUUV Gn的定位一致，确认了Gn是病毒表面最远端、可能屏蔽Gc融合环的糖蛋白。 * 支持数据：图1展示了HTNV Gn的线状图和三维结构图，图1c直观地通过颜色映射显示了与PUUV Gn的RMSD差异。
2. 在酸性pH下，HTNV Gn形成了与中性pH下不同的、更为紧凑的四聚体构象。 * 酸性四聚体的发现：晶体结构显示，在pH 4.0条件下，HTNV Gn分子通过一个广泛的界面（每个界面掩埋约1850 Ų溶剂可及表面积，包含16个氢键）形成了紧密的四聚体。第82至96位残基形成的β发夹结构是形成该界面的关键，它像插销一样嵌入相邻亚基的口袋中。 * 构象差异：这个在晶体中观察到的“酸性四聚体”与根据冷冻电镜重构（在中性pH下）拟合出的Gn四聚体模型在构象上存在显著差异。酸性四聚体的宽度比中性pH下预测的四聚体窄约50 Å，是一种更为紧凑的结构。 * 支持数据：图3a展示了酸性四聚体的整体结构和关键界面细节，图3b直观比较了酸性四聚体与中性pH下预测四聚体的宽度差异。
3. 溶液中的AUC实验证实了Gn蛋白的pH依赖性寡聚化。 * pH影响显著：在中性pH（7.0）下，低浓度的Gn蛋白在溶液中主要以单体形式存在（沉降系数s ~3.5S）。然而，当pH降至4.5时，溶液中出现了明显的更高阶寡聚体，包括二聚体（s ~5.2S）、三聚体（s ~7.2S）和四聚体（s ~8.2S）。 * 实验验证晶体观察：这一结果有力地支持了晶体学观察，表明酸性pH确实能诱导可溶性Gn蛋白发生寡聚化，形成包括四聚体在内的多种高阶复合物，这很可能模拟了病毒在酸性内吞体环境中表面发生的变化。 * 支持数据：图3c的沉降系数分布图清晰地显示了不同pH下Gn蛋白寡聚体分布的变化，并将实验测得的沉降系数与基于晶体结构计算的理论值进行了对比，吻合良好。
4. 冷冻电镜揭示全病毒包膜在酸性pH下发生剧烈的结构转变。 * 晶格解离：在中性pH下，冷冻电镜图像和二维平均图清晰地显示了TULV病毒包膜上规则有序的Gn-Gc糖蛋白晶格。而在pH 5.0条件下，这种规则晶格完全消失，病毒表面呈现出不规则、弥散的状态，表明Gn和Gc之间的同型/异型相互作用被破坏，整个糖蛋白复合物发生了广泛的重组。 * 直接证据：这是在全病毒水平上首次直接观察到汉坦病毒包膜在酸性条件下的不稳定性（metastability）和结构转变。该结果表明，仅酸性环境本身，无需其他宿主因子，就足以触发病毒包膜的结构重排。 * 支持数据：图4展示了不同pH处理下的代表性电镜照片、放大图像和二维平均图，图4g的平均密度分布图定量地显示了膜外侧“尖峰”相关密度的显著变化。
5. 基于所有结果，提出了汉坦病毒包膜在细胞入侵过程中的结构转变模型。 * 模型阐述：研究人员整合了上述所有发现，提出了一个综合模型（图5）来解释酸性pH如何驱动病毒膜融合过程。 * 第一步：屏蔽状态：在中性pH的病毒表面，Gn以相对松散的膜远端四聚体形式覆盖在Gc之上，物理性地屏蔽了Gc上的疏水融合环。 * 第二步：酸性触发重组：病毒进入酸性内吞体后，pH降低诱导Gn发生构象转变，形成更紧凑的酸性四聚体。这种构象变化破坏了Gn与Gc之间的相互作用，导致Gn-Gc晶格解离，并从Gc上“抬起”或“脱离”。 * 第三步：融合环暴露与Gc三聚化：Gn的脱离使得Gc的融合环得以暴露。同时，Gn四聚体变窄提供了空间自由度，使得Gc可以从二聚体状态转变为三聚体状态，形成延伸的融合前中间态构象。随后，Gc三聚体将融合环插入宿主内吞体膜，最终驱动病毒膜与细胞膜的融合。
本研究首次解析了高致病性汉坦病毒——HTNV的Gn糖蛋白结构，确认了汉坦病毒属Gn蛋白折叠结构的高度保守性。更重要的是，通过多学科手段的结合，研究首次系统性地揭示了汉坦病毒包膜糖蛋白晶格在pH触发下的动态可塑性。研究证实，酸性环境不仅能诱导Gc融合蛋白的构象变化，更能引发整个Gn-Gc复合物的协同结构重排：Gn通过形成紧凑的酸性四聚体而从Gc上脱离，从而暴露出Gc的融合环并为Gc的三聚化提供空间。这一发现提供了一个前所未有的分子层面视角，解释了汉坦病毒如何利用其包膜的“亚稳态”特性，在正确的时间和地点（酸性内吞体）启动膜融合过程，完成细胞入侵。