学术研究报告：利用¹⁸O标记与质谱技术发现并表征IgG1抗体中的光氧化组氨酸-组氨酸交联

本研究由来自安进公司（Amgen）分析研发部门的Min Liu、Janet Cheetham，以及工艺与产品开发部门的Zhongqi Zhang、Da Ren，与东北大学巴尼特化学与生物分析研究所的Zhaohui Sunny Zhou共同合作完成。研究成果以题为《Discovery and Characterization of a Photo-oxidative Histidine-Histidine Cross-link in IgG1 Antibody Utilizing ¹⁸O‑Labeling and Mass Spectrometry》的论文，于2014年4月16日在线发表于《Analytical Chemistry》期刊（2014年，第86卷，第4940-4948页）。

一、 学术背景

本研究属于蛋白质组学、生物制药分析化学及蛋白质翻译后修饰研究领域。在生物系统中以及生物制药产品（如治疗性单克隆抗体）中，蛋白质交联是一种普遍存在的现象。这类非预期的共价交联可能导致蛋白质聚集、生物活性丧失，甚至引发免疫原性，从而严重影响治疗性蛋白质药物的质量、安全性与有效性。然而，由于交联结构的复杂性和多样性，尤其是在缺乏对交联化学性质及位点先验知识的情况下，对蛋白质交联进行发现与表征一直是分析化学领域的重大挑战。传统的、基于已知化学反应数据库的搜索策略在此类“未知”交联的鉴定中往往失效。

针对这一难题，该研究团队此前开发了一种名为“XChem-Finder”的工作流程，其核心是利用¹⁸O标记结合质谱技术来系统性地发现和鉴定蛋白质中的未知交联。在本研究中，作者们旨在应用并验证这一创新工作流程，以发现和阐明在治疗性IgG1抗体中，由光照压力诱导产生的一种新型蛋白质交联结构。研究目标明确：首先，确认在光应激IgG1抗体中是否存在新型交联；其次，精确鉴定交联发生的位点与化学结构；最后，探究其可能的形成机制，从而展示XChem-Finder方法在解决复杂蛋白质修饰问题中的强大能力与普适性。

二、 详细工作流程

本研究包含一系列严谨且环环相扣的实验步骤，从样品处理、交联检测到结构确证与机制探讨。

1. 样品制备与应激处理： 研究以重组人源IgG1单克隆抗体为对象。首先，将抗体溶液置换到不同pH值的缓冲液中（pH 4.8的醋酸钠、pH 7.4的磷酸钠、pH 9.0的碳酸氢钠或水），浓度调整为5 mg/mL。随后，将样品置于配备氙灯和ID65太阳滤光片的光照箱中，接受强度为765 W/m²（300-800 nm）的光照，时间分别为7、14和22小时，以模拟不同强度的国际人用药品注册技术协调会（ICH）光照应激条件。同时设置未经光照的对照样品。

2. 交联蛋白的初步检测与量化： 在蛋白水平上，研究采用还原性SDS-PAGE和尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）对光照后样品进行分析。还原性SDS-PAGE用于检测不可还原的高分子量物种（即非二硫键交联），并通过条带强度变化观察其随光照时间增加和pH条件改变的趋势。SEC则在变性条件下对还原后的样品进行分析，通过计算早期洗脱峰的面积百分比，对交联产物的含量进行精确定量。这些初步分析证实了光诱导交联的存在、其pH依赖性（碱性条件更易发生），并量化了交联水平（例如，在3倍ICH光照下，pH 9.0缓冲液中交联产物可达25.8%）。

3. 蛋白酶解与¹⁸O标记（XChem-Finder工作流程的核心第一步）： 为了在肽段水平鉴定交联，研究采用了¹⁸O标记策略。将应激与对照的IgG1抗体进行还原、烷基化（用碘乙酸，IAA）处理后，分为两份。一份在富含¹⁸O的水中进行胰蛋白酶（Trypsin）酶解，另一份在普通的¹⁶O水中进行相同处理。胰蛋白酶切割肽链C端的精氨酸或赖氨酸后，会将水中的氧原子掺入新生成的C端羧基中。因此，一个线性肽段会掺入两个¹⁸O原子（质量增加4 Da），而一个交联肽段包含两个C末端，则会掺入四个¹⁸O原子（质量增加8 Da）。这种独特的同位素质量偏移模式，成为从复杂肽段混合物中筛选出潜在交联肽段的关键标志。

4. 液相色谱-质谱（LC-MS）分析与交联肽段检测： 将¹⁸O和¹⁶O标记的酶解产物分别进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离，并与高分辨质谱（LTQ-Orbitrap）联用分析。通过全扫描（Full MS）比较同一保留时间下肽段同位素簇的质量差异，可以快速锁定那些在¹⁸O样品中相比¹⁶O样品质量增加8 Da的肽段离子，这些即为候选的交联肽段。本研究成功检测到一个四电荷离子m/z 1673.54（¹⁶O标记）及其对应的m/z 1675.54（¹⁸O标记，质量增加8 Da），初步鉴定为一个交联肽段。

5. 交联化学性质与位点的解析： 对候选交联肽段进行串联质谱（MS/MS）分析，采用碰撞诱导解离（CID）模式。通过对碎片离子的解析，并与IgG1重链序列进行比对，研究人员首先推断出该交联涉及一段部分序列（K218-K244）。进一步分析发现，所有碎片离子均匹配自同一段肽段序列（S215-K244）。两个相同未修饰肽段（S215-K244）的理论质量之和为6673.174 Da，而观测到的交联肽段质量为6687.149 Da，两者相差13.975 Da。元素组成分析表明，最合理的解释是增加一个氧原子并失去两个氢原子（O-2H，净增14 Da），这提示发生了氧化反应。鉴于肽段中含有组氨酸（His），且已知组氨酸在光氧化条件下易发生修饰，研究者提出了在两个His残基间形成交联的假设。

6. 多酶解与互补碎裂技术确证结构： 为了确证交联位点和化学结构，研究采用了多种互补策略： * 多蛋白酶酶解： 除了胰蛋白酶，还使用了具有不同切割特异性的蛋白酶，如Asp-N（切割天冬氨酸N端）和Glu-C（切割谷氨酸C端），以及它们的组合（Trypsin+Glu-C, Asp-N+Glu-C）。这些不同的酶切产生了长度各异但都包含推测交联位点的交联肽段（如D217-K224/D217-K224， S215-E229/S215-E229等）。对所有产生的交联肽段进行质谱分析，其观测质量与基于His-His交联（净增14 Da）的理论质量高度吻合（误差在0.0-0.6 ppm以内），且CID MS/MS谱图均能解析出支持His220位点交联的b-和y-系列碎片离子。 * 电子转移解离（ETD）质谱： 作为一种互补的碎裂技术，ETD能够提供不同于CID的序列信息，尤其适用于保留不稳定的翻译后修饰。研究对多个交联肽段进行了ETD MS/MS分析，产生的c-和z-系列离子也一致地将交联位点锁定在His220。 * 不对称肽段生成与验证： 为了最终排除相邻赖氨酸（Lys218）参与交联的可能性（因为序列对称性给鉴定带来挑战），研究者设计了一个巧妙的实验：先使用Trypsin+Glu-C完全酶解，再用Asp-N进行有限时间酶解，从而产生了一个由两条不同长度肽段（D217-E229 / S215-E229）构成的不对称交联肽段。对该不对称肽段的ETD分析显示，碎片离子明确指向氧化发生在较长链的His220上，并且两条链上His220 N端的所有残基（包括Lys218）均未修饰，从而确凿地证明了交联发生在两个重链的His220之间，而非His220与Lys218之间。

7. 形成机制的探讨： 基于质谱鉴定结果和文献报道的模型肽段研究，作者提出了该His-His交联的可能形成机制（如文中Scheme 1所示）：在光照条件下产生的单线态氧攻击组氨酸咪唑环，形成不稳定的内过氧化物中间体，随后转化为2-氧代组氨酸和His+32中间体。后者受到另一个未修饰组氨酸残基的亲核攻击，最终经过水分子消除，形成净增量为14 Da的稳定交联产物。研究在光照样品中检测到了+14 Da（2-氧代组氨酸）和+32 Da（His+32）的氧化中间体肽段，为这一机制提供了直接证据。同时，交联在较高pH下更易发生的现象也与该机制相符（中性咪唑更具亲核性）。

三、 主要研究结果

1. 发现并量化了光诱导的IgG1抗体交联： SDS-PAGE和SEC结果证实，光照在IgG1抗体中诱导产生了不可还原的高分子量交联物种。其形成具有光照时间依赖性和pH依赖性，在碱性条件下更为显著。甚至在未经过特意光照的对照样品中也检测到低水平（~0.4%）的交联，提示此类修饰可能在常规生产与储存过程中即已发生。
2. 鉴定出一种新型的组氨酸-组氨酸（His-His）交联： 通过XChem-Finder工作流程，结合¹⁸O标记和高分辨质谱，首次在完整蛋白质（IgG1抗体）中发现了His-His交联。该交联导致肽段净质量增加14 Da（O-2H）。
3. 精确定位交联位点于重链铰链区His220： 通过多酶解肽图分析、CID与ETD互补的串联质谱碎裂技术，以及不对称交联肽段的验证，所有数据一致且确凿地将交联位点定位在两个重链的相同残基——铰链区的His220上。该区域高度柔性且溶剂可及，为光氧化反应提供了有利环境。
4. 揭示了交联的化学机制： 质谱检测到了理论机制中的关键氧化中间体（+14 Da和+32 Da的修饰肽段），结合交联的pH依赖性，支持了基于单线态氧反应和亲核攻击的形成机制。
5. 观察到其他交联形式： 研究同时检测到文献已报道的、发生在重链铰链区与轻链C端之间的硫醚（Thioether）交联，表明光照应激可能引发多种类型的交联反应。

四、 研究结论与意义

本研究成功应用并验证了XChem-Finder工作流程，在治疗性IgG1抗体中发现并全面表征了一种此前未知的光氧化诱导的组氨酸-组氨酸交联。研究结论表明，这种交联发生在抗体高度保守的铰链区His220位点，其形成机制与光氧化反应途径一致。

该研究的科学价值与应用价值在于： 1. 方法学价值： 有力证明了XChem-Finder工作流程是一种强大且通用的工具，能够在无需任何先验化学知识的情况下，系统地发现和鉴定蛋白质中的未知交联结构。这为复杂生物制药产品、乃至生命科学中未知蛋白质修饰的研究提供了全新的解决方案。 2. 生物制药质量研究价值： 首次在治疗性抗体中报道了His-His交联，拓宽了对抗体药物在生产和储存过程中可能发生的降解途径的认识。这种发生在保守位点的修饰可能普遍存在于其他IgG1分子中，对其结构、稳定性、效力和潜在免疫原性具有重要影响，为抗体药物的工艺开发、配方优化和稳定性评估提供了关键信息。 3. 机制认知价值： 将小分子模型肽中已知的光氧化组氨酸反应机制，在完整的、具有复杂高级结构的治疗性蛋白质中得到了验证和关联，加深了对蛋白质光化学损伤的理解。

五、 研究亮点

1. 创新性的发现： 这是首个在完整蛋白质中鉴定出光氧化诱导的组氨酸-组氨酸交联的报道。
2. 强大的方法学： 研究核心亮点在于XChem-Finder工作流程的成功应用。该方法利用¹⁸O标记产生的独特同位素模式作为“钓饵”，从海量质谱数据中高效筛选出交联肽段，克服了传统数据库搜索方法的局限。
3. 严谨的结构确证： 研究采用了多蛋白酶解、CID/ETD互补碎裂、不对称肽段生成等多层次、多角度的质谱分析策略，提供了极其坚实和完整的证据链，令人信服地确定了交联的化学本质和精确位点。
4. 系统的机制研究： 不仅鉴定了最终交联产物，还检测到了关键的反应中间体，并将修饰水平与pH条件关联，从而将分析化学鉴定与反应机制探讨紧密结合。

六、 其他有价值的内容

研究还简要讨论了在同一光照样品中观察到的硫醚交联，提示不同交联类型可能共存，并共同贡献于观察到的蛋白聚集现象。这反映了生物制药中蛋白质降解途径的复杂性。作者在文末展望，随着质谱技术的快速发展（如更高分辨率、更多互补碎裂机制），XChem-Finder方法有望在发现和阐明其他新型蛋白质交联方面取得同样成功。