本研究由Richard You Wu（#，与Bo Li并列贡献）、Bo Li（#，与Richard You Wu并列贡献）、Yuhki Koike、Pekka Määttänen、Hiromu Miyake、Marissa Cadete、Kathene C. Johnson-Henry、Steven R. Botts、Carol Lee、Thomas R. Abrahamsson、Eva Landberg、Agostino Pierro及通讯作者Philip M. Sherman领导完成。作者团队来自加拿大安大略省多伦多市的Hospital for Sick Children（病童医院）及其关联的University of Toronto（多伦多大学），以及瑞典Linköping University（林雪平大学）。该研究发表在期刊《Molecular Nutrition & Food Research》上，其文章于2018年10月31日被接收（修订于2018年10月29日，初次提交于2018年7月4日），文章的DOI标识为10.1002/mnfr.201800658。
本研究的学术背景聚焦于新生儿医学与营养学，特别是针对早产儿中一种严重的肠道疾病——坏死性小肠结肠炎。坏死性小肠结肠炎是早产儿发病和死亡的主要原因之一，其发病率在配方奶喂养的婴儿中显著高于母乳喂养的婴儿。母乳中富含一类名为人乳低聚糖的复杂碳水化合物，其含量高达5-15克/升。既往在人类和动物模型中的研究均表明，人乳低聚糖能够降低坏死性小肠结肠炎的发病率，但其发挥保护作用的具体分子机制尚不明确。已知人乳低聚糖具有多种生物学功能，包括刺激肠道有益菌生长、阻止肠道病原体粘附以及调节宿主免疫反应。此外，坏死性小肠结肠炎的发展与肠道黏液层的耗竭和特定人乳低聚糖成分的缺乏有关。黏液层主要由杯状细胞分泌的黏蛋白（特别是MUC2）构成，是隔离肠道细菌、保护上皮细胞的重要物理化学屏障。基于以上背景，本研究提出科学假设：人乳低聚糖通过增强和维持肠道黏液屏障的完整性来预防坏死性小肠结肠炎的发生。因此，研究旨在探索人乳低聚糖是否以及在何种机制下能够上调肠道黏蛋白（尤其是MUC2）的表达，从而在实验性坏死性小肠结肠炎模型中提供保护。
研究流程详尽，整合了体内动物模型、体外细胞系及人类肠类器官等多种研究体系。首先，研究人员从4位健康母亲捐赠的母乳中收集、混合样本，进行巴斯德消毒以去除潜在细菌影响，然后通过离心去除脂肪、丙酮沉淀蛋白质、凝胶过滤色谱去除残留盐分和乳糖等一系列步骤，提取并纯化了混合人乳低聚糖。采用高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测法对提取物中的主要人乳低聚糖成分进行了定性和定量分析，明确了其组成。
体内研究的核心是构建新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型。具体流程为：在出生后第5天，将C57BL/6品系的新生小鼠按窝随机分组。坏死性小肠结肠炎诱导方案包括每日三次缺氧刺激、三次配方奶灌胃（模拟配方奶喂养），并在第6-7天腹腔注射脂多糖。实验组在配方奶中添加了人乳低聚糖，剂量为每天每克体重2-3毫克；对照组则包括仅配方奶组、以及添加等渗乳糖的配方奶组（以排除单纯糖类的非特异性效应）。整个处理持续至出生后第9天。研究期间监测小鼠体重。实验终点时，评估肠道大体形态，并收集末端回肠组织进行石蜡包埋切片。通过苏木精-伊红染色进行组织病理学评分（由两名不知分组的研究者独立进行盲法评分，评分标准从0级无损伤到4级透壁性坏死），评分≥2级被判定为坏死性小肠结肠炎阳性。为评估肠道屏障功能，在诱导结束后给小鼠灌胃荧光素标记的右旋糖酐，4小时后采集血液测量血清中右旋糖酐的荧光强度，以量化肠道通透性。同时，利用免疫荧光染色和阿尔新蓝-过碘酸雪夫染色技术，对回肠切片中的MUC2阳性杯状细胞进行定位和计数。还通过蛋白质免疫印迹和实时定量聚合酶链反应，分别检测了回肠组织中MUC2蛋白以及MUC2、TFF3等基因的转录水平。
体外研究部分使用了两种人类肠道上皮细胞系：LS174T细胞（具有杯状细胞表型，高水平分泌MUC2）和Caco-2bbe1细胞（肠上皮细胞表型，低水平分泌MUC2）。细胞经不同浓度人乳低聚糖处理后，通过阿尔新蓝染色观察黏液分泌，通过实时定量聚合酶链反应检测MUC2和TFF3的mRNA表达。更重要的是，研究利用了从3名接受坏死性小肠结肠炎狭窄段切除术的早产儿正常回肠组织中分离培养出的人类肠道类器官。这些类器官在添加人乳低聚糖的培养基中培养24小时后，评估其隐窝出芽情况和MUC2的mRNA表达。为探究人乳低聚糖对肠道屏障功能的直接影响，研究在Caco-2bbe1细胞单层模型上进行了系列实验：细胞生长在Transwell小室上形成紧密单层，预先用人乳低聚糖处理，然后用人肠道致病性大肠杆菌进行攻击。通过测量跨上皮电阻评估屏障完整性；通过荧光标记的鬼笔环肽染色观察由细菌引起的“粘附-抹平”损伤；并通过检测荧光右旋糖酐从顶端至基底侧的渗透率来评估旁细胞通透性。
为了阐明人乳低聚糖上调黏蛋白的可能机制，研究重点关注了内质网应激与蛋白质折叠伴侣。通过蛋白质免疫印迹检测了人乳低聚糖处理后的细胞以及小鼠回肠组织中内质网伴侣蛋白的表达，包括蛋白二硫键异构酶和结合免疫球蛋白蛋白。此外，还通过实时定量聚合酶链反应检测了内质网应激相关标志物的转录水平。为了验证PDI在人乳低聚糖保护作用中的必要性，研究使用了两种PDI抑制剂：16F16和芦丁水合物。在体外，将抑制剂与人乳低聚糖共同处理Caco-2bbe1细胞，再观察其对细菌粘附损伤和跨上皮电阻的影响。在体内，通过灌胃将芦丁水合物与人乳低聚糖同时给予坏死性小肠结肠炎模型小鼠，随后评估其对肠道损伤、MUC2阳性细胞数量的影响，从而验证抑制PDI活性是否会消除人乳低聚糖的保护效果。
研究取得了一系列明确且相互印证的结果。在体内模型中，人乳低聚糖喂养能显著减轻坏死性小肠结肠炎的病理损伤。与仅配方奶组或配方奶加乳糖组相比，人乳低聚糖组小鼠的末端回肠保持了完好的绒毛结构，组织病理学评分显著降低（人乳低聚糖组坏死性小肠结肠炎阳性率为0%，而对照组高达80%），且体重无差异。机制上，人乳低聚糖有效逆转了坏死性小肠结肠炎诱导导致的杯状细胞耗竭，显著增加了回肠中MUC2阳性细胞的数量和MUC2蛋白的表达水平，同时降低了肠道对右旋糖酐的通透性。在体外，人乳低聚糖处理能上调LS174T和Caco-2bbe1细胞中MUC2的mRNA表达（在LS174T细胞中还上调了TFF3），并增强了细胞的黏液染色。从早产儿肠道培养的类器官在加入人乳低聚糖后，也显示出MUC2 mRNA表达的上调。功能上，人乳低聚糖预处理能剂量依赖性地减少致病性大肠杆菌在Caco-2bbe1单层细胞上形成的“粘附-抹平”损伤病灶数量，维持更高的跨上皮电阻，并完全逆转了由细菌引起的右旋糖酐渗透性增加。这些结果共同表明，人乳低聚糖能直接增强肠道上皮的黏蛋白表达和屏障功能。
深入的机制探索揭示，人乳低聚糖能够诱导内质网应激相关伴侣蛋白的表达。在体外细胞和小鼠肠道组织中，人乳低聚糖处理均上调了PDI和BIP的蛋白水平。小鼠组织中内质网应激标志物的mRNA水平也相应升高。关键的验证实验发现，使用PDI抑制剂（16F16或芦丁水合物）处理后，人乳低聚糖在体外对跨上皮电阻的保护作用以及对细菌粘附损伤的减少作用被完全阻断。更重要的是，在体内坏死性小肠结肠炎模型中，同时给予芦丁水合物抑制PDI活性，也消除了人乳低聚糖对肠道损伤的保护作用以及对MUC2阳性杯状细胞的维持作用。这些数据有力地证明了PDI的活性对于人乳低聚糖介导的肠道保护是必需的。
本研究得出结论：人乳低聚糖通过上调肠道黏蛋白（特别是MUC2）的表达来增强肠道黏液屏障功能，这是其预防实验性坏死性小肠结肠炎的重要机制之一。人乳低聚糖能够直接作用于肠道上皮细胞，诱导内质网应激伴侣蛋白PDI的表达，而PDI对于黏蛋白的正确折叠和功能至关重要。当PDI活性被抑制时，人乳低聚糖的保护效应也随之消失。这为解释为何母乳喂养能降低早产儿坏死性小肠结肠炎风险提供了新的分子层面的见解。本研究的科学价值在于首次在坏死性小肠结肠炎的背景下，建立了人乳低聚糖、内质网应激伴侣蛋白、黏蛋白表达及肠道屏障功能之间的因果联系，深化了我们对母乳生物活性成分作用机制的理解。其应用价值在于为未来开发基于特定人乳低聚糖结构或模拟其作用途径的营养干预策略（如特制配方奶添加剂）以预防坏死性小肠结肠炎，提供了重要的理论依据和潜在的药物靶点。
本研究的亮点突出。首先，在研究内容上，它首次系统揭示了人乳低聚糖通过诱导PDI依赖性途径上调MUC2黏蛋白以保护肠道屏障、抵抗坏死性小肠结肠炎的新机制。其次，在研究模型与方法上，它采用了多层次、多体系的综合性研究策略：从体内新生小鼠疾病模型，到体外经典肠上皮细胞系，再到前沿的人类新生儿肠道类器官模型，相互验证，证据链完整。特别是利用临床手术样本建立早产儿肠道类器官，极大地增强了研究结果与人类病理生理的相关性。此外，研究不仅观察了表型效应（损伤减轻、屏障增强），还通过药理学抑制剂（PDI抑制剂）进行功能性逆向验证，明确了PDI在该通路中的关键作用，使机制阐述更为扎实。最后，研究样本的处理和分析严谨，如使用混合人乳低聚糖以模拟母乳复杂性，设立乳糖等渗对照组以排除渗透压等非特异性干扰，组织学评分采用盲法，统计分析规范，确保了结果的可靠性。这些亮点共同构成了一个设计严谨、逻辑清晰、具有重要创新性和转化潜力的高水平研究。