快速高分辨率微型双光子显微镜实现自由活动小鼠大脑成像的突破性研究

作者及机构
本研究由北京大学分子医学研究所膜生物学国家重点实验室的陈良怡、程和平领衔，联合北京基础医学研究所认知科学系、苏州生物医学工程技术研究所等多家单位共同完成，发表于2017年7月的《Nature Methods》期刊（Vol.14 No.7）。

学术背景
神经科学的核心目标之一是解析自由活动动物在亚细胞、细胞及神经环路层面的信息处理机制。尽管微型化显微镜技术已能观测动物自主行为中的脑活动，但对自由活动动物单个树突棘（dendritic spine）活动的解析仍存在挑战。传统头固定（head-fixed）双光子显微镜（two-photon microscopy, TPM）虽能实现高分辨率成像，但限制了动物的自然行为并可能引入应激干扰。此外，现有微型双光子显微镜（miniaturized TPM, mTPM）因激光传输效率低、运动伪影等问题，难以稳定捕捉树突棘级活动。本研究旨在开发一种新型微型双光子显微镜（fast high-resolution miniature TPM, FHIRM-TPM），以实现在自由活动小鼠中高时空分辨率成像。

研究流程与方法
1. FHIRM-TPM系统设计
- 光学核心创新：
采用定制空心光子晶体光纤（hollow-core photonic crystal fiber, HC-PCF）传输920 nm飞秒激光，解决传统光纤非线性脉冲展宽问题。该光纤（HC-920）在1米长度下脉冲宽度仅展宽至100 fs，支持高效激发绿色荧光蛋白（GFP）和钙离子探针（GCaMP6）。
*微型物镜*：NA 0.8的复消色差物镜，理论分辨率达横向0.506 μm、轴向3.063 μm，实际测量值为横向0.64±0.02 μm、轴向3.35±0.37 μm。
- 机械结构：
头戴部分重量仅2.15 g，集成微机电系统（MEMS）扫描镜（扫描频率6 kHz，最大视场130×130 μm²）和柔性光纤束（supple fiber bundle, SFB），通过双螺丝固定于小鼠颅骨，确保运动稳定性。
- 成像模式：支持40 Hz全帧扫描、10 kHz线扫描及128 Hz随机访问成像，满足不同实验需求。

1. 性能验证实验

   • 分辨率测试：
     使用100 nm荧光微球嵌入琼脂糖凝胶，实测分辨率接近衍射极限，显著优于现有微型宽场显微镜（补充表3）。
     
   • 对比实验：
     在Thy1-GFP转基因小鼠固定脑片中，FHIRM-TPM与台式TPM成像对比显示，两者在树突棘形态解析上无显著差异（图3a）；而微型宽场显微镜因离焦背景信号无法分辨细节。
     
   • 功能成像：
     在表达GCaMP6f的小鼠前额叶皮层中，FHIRM-TPM记录的钙瞬变（ΔF/F≈150%）与台式TPM相当，但宽场显微镜仅能检测到胞体信号（ΔF/F 5-10%），且漏检大部分树突活动（图3b-d）。

2. 自由行为范式应用

   • 行为场景构建：
     设计可旋转轴承与电滑环组合，避免小鼠自由探索时连接线缠绕。通过三视角摄像头同步记录行为（图4a）。
     
   • 长时程稳定性测试：
     在4小时连续实验中（包括悬尾、台阶下行、社交互动），视场漂移<10 μm，帧间位移<0.24 μm（图4c）。
     
   • 树突棘活动解析：
     在V1皮层中，首次观察到自由活动小鼠树突棘的局部活动（与父树突不同步）及全局活动（同步激活），证实技术鲁棒性（图4d）。

主要结果与逻辑关联
1. 技术性能验证：HC-920光纤与MEMS扫描镜的组合解决了激光传输与高速成像的瓶颈，使FHIRM-TPM在分辨率、信噪比上媲美台式设备（图1-2）。
2. 行为相关性发现：自由探索小鼠的V1皮层神经元活动显著高于头固定状态（补充图6），提示运动对视觉皮层的调控作用，与多电极记录研究一致[20,21]。
3. 应用拓展性：随机访问成像模式可解析钙瞬变亚秒级时序特征（图4f），为未来结合光遗传学操控奠定基础。

结论与价值
1. 科学价值：FHIRM-TPM首次实现自由活动动物树突棘级活动的高分辨率成像，填补了行为神经科学在亚细胞尺度观测工具的空缺。
2. 应用潜力：该系统支持多种行为范式（如社交、悬尾），为研究自然状态下神经编码提供了新范式。其低功耗（10-20 mW）和轻量化设计适用于长期实验。
3. 技术普适性：通过更换物镜（如NA 0.7透镜），可扩展至深层脑区或更大动物模型（如大鼠、狨猴）的多区域同步成像。

研究亮点
- 创新技术：HC-920光纤与微型高NA物镜的组合为首次报道，解决了920 nm飞秒激光高效传输的难题。
- 行为兼容性：在剧烈运动（如挣扎、社交）中仍能稳定记录树突棘活动，突破了传统mTPM的限制。
- 多模态成像：集成全帧扫描、线扫描与随机访问模式，兼容电压探针与光遗传学工具的未来应用。

其他价值
研究团队公开了显微镜组装协议（Supplementary Protocol），并提供了全部技术图纸（Supplementary Data），推动技术标准化。此外，该系统在苏州脑科学仪器创新中心实现成果转化，具备产业化潜力。