本研究由Fergus J. Byrne、Sinéad M. Waters、Peadar S. Waters、William Curtin和Michael Kerin共同完成，研究机构包括爱尔兰戈尔韦Merlin Park地区医院骨科、爱尔兰Teagasc动物繁殖研究中心以及爱尔兰国立大学戈尔韦分校和戈尔韦大学学院医院外科系。该研究成果发表于《European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology》，文章编号DOI 10.1007/s00590-007-0221-5，于2007年由Springer-Verlag出版。
假体关节感染是全关节置换术（total joint arthroplasty）后一种严重的并发症，会导致患者出现显著的并发症发生率。在假体相关感染中，最常见的病原菌是葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）的成员，其中包括表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。表皮葡萄球菌是一种凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci），同时也是普遍存在于皮肤表面的共生菌，已成为假体关节感染的重要致病因子，占假体关节感染病例的30%至43%。
长期以来，培养法一直是诊断这类感染的“金标准”（gold standard），通过对假体周围组织进行培养来检测病原体。然而，这种方法在灵敏度和检测时间方面存在明显缺陷：常规培养方法可能需要数天才能得出最终结果，而且术前使用抗生素可能导致培养结果呈假阴性。此前已有关于“培养阴性”（culture negative）骨髓炎病例的报道。
为了克服培养法在骨科细菌感染诊断中的局限性，分子生物学方法已被引入。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术已被广泛应用于骨科领域以鉴别细菌感染，其中16S核糖体RNA基因（16S rRNA gene）是最常用的检测靶点。然而，使用针对16S rRNA基因的引物存在假阳性结果高发的问题，因为这种方法灵敏度极高，甚至能检测到标本采集后才引入的临床无关微生物的微量污染。
提高PCR特异性的方法之一是使用针对特定物种基因片段的引物。此外，在开发用于微生物检测的灵敏PCR方法时，另一个关键问题是确定从样本中提取DNA的最佳方法。最佳的样本处理流程应能高效地释放多种靶标微生物的DNA，并去除不同样本类型中的抑制因子，同时不引入外源性细菌DNA污染。由于滑液（synovial fluid）复杂的分子构成，从中提取和扩增DNA存在困难，可能导致PCR抑制及假阴性结果。
实时聚合酶链式反应（real time PCR）技术基于对PCR过程中荧光信号的检测和定量，具有极高的灵敏度。文献中首次且唯一将实时PCR应用于骨科感染检测的报告由Kobayashi等人发表，该方法用于鉴定培养阴性骨髓炎中的细菌，但该检测方法并非物种特异性的，也非完全定量的。
因此，本研究的目的是开发一种快速、可靠、灵敏且可重复的实时PCR方法，用于检测假体关节置换手术的冲洗液样本中的表皮葡萄球菌。
研究从初次髋关节和膝关节置换术的术后冲洗液中以无菌技术采集了60份样本。冲洗液成分为0.9%生理盐水，取自假体复位后的第一次冲洗液。每份样本采集双份，每份40毫升，储存于-20°C。其中一份用于常规微生物培养分析，另一份用于分子生物学检测。
为模拟被表皮葡萄球菌污染的冲洗液样本，研究人员将手术中获取的冲洗液基质经过辐照灭菌后，加入已知浓度的表皮葡萄球菌纯培养物。研究中使用了购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）的表皮葡萄球菌ATCC 8558菌株，并通过API试纸条分析确认了菌株身份以保证无污染。
研究者评估了五种DNA提取方法对掺入不同浓度表皮葡萄球菌（1×10⁹、1×10⁶、1×10³和0菌落形成单位）的无菌冲洗液样本的提取效果： 1. 标准酚/氯仿纯化法加乙醇沉淀； 2. Kuipers等人描述的方案； 3. Wizard细菌基因组DNA分离试剂盒（Promega公司）； 4. Qiagen DNA小提试剂盒（硅胶柱法）； 5. Sigma细菌DNA分离试剂盒。
所有方法提取的DNA均在紫外分光光度计上测量260/280比值，以评估DNA的纯度和回收量。结果显示，Wizard细菌DNA分离试剂盒在所有稀释度下均实现了最高的DNA回收率，所提取的DNA具有最高的质量和数量。Kuipers等人的方法回收率略低，而Qiagen和Sigma试剂盒的效果较差。所有方法提取的DNA其A260/A280比值均在1.6-1.8范围内，表明纯度适合PCR反应。因此，后续分子生物学研究均采用Wizard试剂盒进行DNA提取。
研究人员利用软件程序“Primer3”设计了一对寡核苷酸引物，即5’staph epi F和3’staph epi R，用于扩增表皮葡萄球菌特异性基因gseA（谷氨酸特异性丝氨酸蛋白酶编码基因）的一段193碱基对区域。通过国家生物技术信息中心（NCBI）网站上的基本局部比对搜索工具（BLAST）进行序列分析，确认了该引物的物种特异性。
使用这对引物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和耳葡萄球菌（S. auricularis）的基因组DNA进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示，仅表皮葡萄球菌生成了正确大小的PCR产物（约200碱基对），而阴性对照没有任何扩增产物。对阳性PCR产物进行测序和BLAST分析，进一步确认了该产物对表皮葡萄球菌的特异性。
在实时PCR条件优化中，研究者测试了不同引物浓度（300 nM、50 nM、25 nM和5 nM），最终确定50 nM为最佳引物浓度，因为该浓度提供了最低的循环阈值（Ct值），且较低浓度的引物获得的Ct值显著更高。
为了生成标准曲线，研究人员将无菌冲洗液掺入10¹³至10¹菌落形成单位的表皮葡萄球菌，每个浓度设三个重复。利用SYBR Green实时PCR技术进行扩增，反应体系总体积为50微升，在ABI Prism 7500序列检测仪上运行。扩增程序为：50°C 2分钟；95°C 10分钟激活Ampli Taq Gold聚合酶；随后进行35个循环（95°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒）；最后为延伸阶段（95°C 1分钟，60°C 1分钟，95°C 19.59分钟）。
溶解曲线分析显示，所有标准品的平均熔解温度（Tm）为84°C（范围81.5-86.5°C），扩增产物高度特异，不存在引物二聚体，表明反应效率极高。阴性对照未产生任何熔解峰。
60份手术冲洗液样本均经过常规微生物培养分析，在有氧和厌氧条件下均未显示任何细菌生长，全部为培养阴性。使用本研究开发的新型物种特异性SYBR Green实时PCR方法对这些样本进行检测，同样未在任何样本中检测到表皮葡萄球菌。这一结果与患者未表现出任何感染症状的临床观察相一致，支持了这些冲洗液样本确实为阴性，且不含表皮葡萄球菌的结论。
标准曲线以表皮葡萄球菌菌落形成单位的对数值为横轴，以对应的Ct值为纵轴进行绘制，显示出良好的线性关系（决定系数r² = 0.9827）。各浓度标准品Ct值的标准偏差很小，表明检测具有高度的可重复性。该检测方法的灵敏度极限为每个样本少于10个菌落形成单位（CFU），相当于每50毫升冲洗液样本中少于10 CFU。
为评估方法的可重复性，研究者将完整的实时PCR检测流程在三个不同时间点重复操作，对标准品中的表皮葡萄球菌进行测定，结果一致，确认了该技术具有良好的可重复性。
本研究成功开发出一种新型、快速、灵敏且可重复的实时PCR方法，可用于特异性检测和定量假体关节置换手术冲洗液样本中的表皮葡萄球菌。这是首篇关于从骨科冲洗液样本中优化提取细菌基因组DNA，并利用实时PCR技术对该菌种进行特异性定量的分子生物学方法报告。
该方法的科学价值在于：首先，它不依赖于培养，整个检测流程可在约4小时内完成（DNA提取不到2小时，实时PCR仅需2小时），显著缩短了传统培养所需的数天周转时间；其次，该方法极其灵敏，可检测低至10 CFU的反应水平的表皮葡萄球菌；第三，该方法具有物种特异性，避免了使用16S rRNA基因引物所带来的假阳性问题。
在应用价值方面，该方法为假体关节感染的快速诊断提供了新的可能性。此前的研究已表明，实时PCR甚至能在培养阴性的骨髓炎临床样本中检测到葡萄球菌属细菌的存在，说明其灵敏度优于传统培养法。虽然本研究中的60份样本均未检出表皮葡萄球菌，但需要指出的是，这些样本来自初次置换手术，患者均无感染症状，因此这一结果是合理的。
然而，为了充分验证该新型实时PCR方法的有效性，研究者建议需要在更大样本量（超过1000名患者）中进行测试。此外，研究还讨论了如何克服该方法可能从死细胞中扩增DNA的局限性，建议未来可通过结合逆转录步骤来区分活菌和死菌，或采用微阵列技术检测微生物的mRNA来专门鉴定活菌。
本研究具有多个显著亮点。首先，在方法学上首次系统比较了多种DNA提取方法在骨科冲洗液样本中的适用性，明确筛选出最优方案，为后续研究奠定了坚实基础。其次，针对表皮葡萄球菌特有基因gseA设计的引物实现了真正意义上的物种特异性检测，有效避免了泛细菌PCR方法中常见的假阳性问题。第三，通过构建标准曲线实现了对目标菌株的准确定量，这是以往同类骨科感染分子检测研究所缺乏的。最后，对实验全过程实施了严格的质量控制措施，包括PCR试剂的紫外线照射处理、在层流柜中配制反应体系以及手术中严格遵守无菌技术，最大限度地减少了外源性DNA污染的风险。