本研究由美国加州大学旧金山分校（University of California, San Francisco）神经外科系的 Ethan A. Winkler、Chang N. Kim 以及 Daniel A. Lim、Tomasz J. Nowakowski 等多位研究者合作完成，相关成果发表于 Science 杂志，2022 年 3 月 4 日，第 375 卷第 6584 期，文章编号为 eabi7377。研究团队利用单细胞 RNA 测序（scRNAseq）技术，构建了成年人脑血管系统的单细胞转录组图谱，并进一步解析了脑动静脉畸形（arteriovenous malformations, AVMs）中的细胞与分子异常。
脑血管疾病是全球范围内导致死亡和神经功能障碍的主要原因之一。深入了解人脑血管系统的细胞组成和分子特征，对于阐明疾病机制和开发治疗策略至关重要。脑血管系统由动脉、小动脉、毛细血管、小静脉和静脉等不同节段组成，这些节段在功能上具有显著差异，并沿“动静脉轴”（arteriovenous axis）有序排列。血管壁由内皮细胞（endothelial cells）、周细胞（pericytes）、平滑肌细胞（smooth muscle cells）和血管周围成纤维细胞（perivascular fibroblasts）等多种细胞类型构成。此前，小鼠模型中的单细胞测序研究已揭示了脑血管细胞的部分异质性，但由于细胞分离技术的限制，人类脑血管系统的细胞多样性长期未被充分探索。因此，本研究旨在通过大规模单细胞转录组测序，建立人类脑血管系统的细胞图谱，并以脑动静脉畸形为疾病模型，展示该图谱在解析脑血管疾病分子机制中的应用价值。
本研究主要包括三个核心实验阶段：正常人脑血管细胞图谱的构建、脑动静脉畸形细胞图谱的构建，以及基于两种图谱的联合分析与功能验证。
第一阶段：正常人脑血管细胞图谱的构建。 研究团队从 5 名因癫痫接受大脑皮层切除术的患者中获取了正常大脑皮层组织。首先在显微镜下手工分离较大的动脉和静脉，随后利用葡聚糖梯度离心和细胞筛过滤的方法富集微血管片段。将微血管片段与大血管混合后，使用胶原酶 II 消化成单细胞悬液，再通过 10x Genomics Chromium 平台进行单细胞 RNA 测序。最终获得 74,535 个高质量细胞转录组。利用基于图的 Leiden 聚类算法，研究人员识别出 15 种主要细胞群体，包括内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、血管周围成纤维细胞以及多种免疫细胞和神经胶质细胞。为了在空间上验证这些细胞类型的定位，研究团队使用了 Rebus Esper 空间组学平台进行多重单分子荧光原位杂交（smFISH），该平台整合了合成孔径光学（synthetic aperture optics, SAO）显微镜和自动化图像处理软件，能够同时检测 16 个标记基因的表达并定位到单个细胞。
第二阶段：脑动静脉畸形细胞图谱的构建。 研究团队从 5 名经血管造影确诊的未破裂脑动静脉畸形患者中获取手术切除组织。采用与正常组织相同的血管分离和单细胞测序流程，共获得 106,853 个高质量细胞转录组，并识别出 11 种主要细胞群体。通过将正常与 AVM 数据集的细胞进行共嵌入（co-embedding）分析，研究者能够直接比较两种状态下各类血管细胞的转录组差异。
第三阶段：联合分析与功能验证。 在联合分析中，研究者对共嵌入后的内皮细胞和血管周围细胞进行了迭代聚类，识别出 AVM 特有的内皮细胞亚群，并利用 RNA 速度（RNA velocity）分析预测细胞状态转变轨迹。此外，还使用 CellChat 算法推断细胞间配体-受体相互作用网络。为了验证单细胞分析结果，研究团队利用 scMappR 算法对 39 例 AVM 患者（其中 26 例破裂，13 例未破裂）的批量 RNA 测序数据进行细胞类型组成反卷积，以识别与 AVM 破裂相关的细胞状态。最后，通过体外共培养实验和细胞凋亡检测，验证了特定免疫细胞亚群对血管平滑肌细胞的致病作用。
正常人脑血管系统的细胞异质性。 研究团队在正常脑血管系统中鉴定出 6 个内皮细胞亚群，这些亚群分别对应于动脉、毛细血管、小静脉和静脉等不同动静脉节段。通过与已发表的小鼠内皮细胞图谱进行相关性分析，证实了人类内皮细胞动静脉分区（zonation）的保守性。此外，还发现了一个富集 TXNIP 基因的动脉内皮细胞亚群，提示可能存在代谢状态特异的动脉内皮细胞。在血管周围细胞方面，除了已知的周细胞、平滑肌细胞和血管周围成纤维细胞外，研究团队还发现了一种此前未在脑血管系统中报道的细胞类型——“纤维肌细胞”（fibromyocytes）。该细胞类型同时表达成纤维细胞标记基因（如 *DCN*、*LUM*）和巨噬细胞相关基因（如 *LGALS3*），但缺乏平滑肌细胞转录因子 MYOCD 的表达。通过空间转录组学验证，纤维肌细胞确实存在于人脑血管周围。RNA 速度分析提示纤维肌细胞可能由平滑肌细胞转化而来，但这需要进一步的谱系示踪实验加以证实。
脑动静脉畸形中的内皮细胞异常。 通过将正常与 AVM 数据集共嵌入分析，研究者发现 AVM 中的内皮细胞主要富集动脉和静脉的转录特征，而毛细血管和小静脉的特征显著受抑。进一步迭代聚类鉴定出两个 AVM 特有的内皮细胞状态，命名为 nidus 1（ND1）和 nidus 2（ND2）。ND2 细胞表现出最显著的差异基因表达，包括上调 *PLVAP*（一种在发育性血管生成和脑室周围器官中表达的内皮窗孔标记基因）和 *PGF*（胎盘生长因子，一种强效的脑血管生成刺激因子）。同时，ND2 细胞抑制了正常毛细血管内皮细胞中高表达的血脑屏障营养转运体基因（如 *MFSD2A*、*SLC16A1*、*SLC38A5*），并上调促炎基因（如 *CCL14*）和促通透性基因（如 *ANGPT2*）。空间转录组学验证了 ND2 内皮细胞定位于 AVM 的畸形血管巢（nidus）中。细胞间通讯分析显示，ND2 是 AVM 中异常细胞通讯网络的最强贡献者，涉及血管生成素、血管内皮生长因子和转化生长因子 β 等信号通路，以及此前未被识别的 CD99、SPP1 和 CALCR 等免疫激活和血管生成相关通路。
AVM 中的免疫微环境与血管破裂机制。 研究团队在共嵌入数据集中鉴定出 17 个免疫细胞亚群，包括 9 个髓系细胞亚群和 8 个淋巴系细胞亚群。在 AVM 中，循环免疫细胞（如 CD8+ T 细胞）从血管腔内浸润到血管周围间隙和邻近脑实质。髓系细胞在 AVM 中数量增加并表现出激活状态。通过对 39 例 AVM 批量 RNA 测序数据的反卷积分析，研究者发现一个表达 GPNMB 的单核细胞亚群（MO3）在破裂的 AVM 中显著富集，且该亚群的丰度与平滑肌细胞的丰度呈负相关。体外共培养实验证实，从破裂 AVM 患者外周血中分离的 GPNMB+ 单核细胞能够诱导原代人脑血管平滑肌细胞凋亡。进一步的细胞通讯分析揭示，GPNMB+ 单核细胞通过分泌骨桥蛋白（osteopontin, OPN，由 SPP1 基因编码）作用于平滑肌细胞表面的 CD44 和整合素受体，从而促进平滑肌细胞死亡。使用 CD44 中和抗体或整合素抑制剂可显著减轻 OPN 诱导的平滑肌细胞凋亡。
本研究首次构建了基于单细胞转录组学的成年人脑血管系统细胞图谱，系统描绘了内皮细胞的动静脉分区特征和血管周围细胞的多样性，并发现了纤维肌细胞这一新的脑血管细胞类型。通过将该图谱应用于脑动静脉畸形，研究揭示了 AVM 中内皮细胞的病理性转化、血管周围细胞和免疫细胞的异常通讯网络，以及 GPNMB+ 单核细胞通过 OPN-CD44/整合素通路促进平滑肌细胞凋亡并参与 AVM 破裂的机制。该研究为理解脑血管疾病的细胞和分子基础提供了重要的参考资源，也为开发针对血管生成和炎症通路的治疗策略提供了新靶点。
本研究的亮点主要体现在三个方面。首先，研究对象具有独特性：此前人类脑细胞图谱研究因分离技术的限制而普遍忽略了脑血管系统，本研究通过优化的血管分离流程成功富集了脑血管细胞，填补了该领域的空白。其次，方法上采用了单细胞测序与多重空间转录组学相结合的策略，并使用了新型的 Rebus Esper 空间组学平台，实现了单细胞分辨率下的空间定位验证。最后，在科学发现上，研究首次在人类脑血管系统中鉴定出纤维肌细胞，并揭示了 GPNMB+ 单核细胞在 AVM 破裂中的致病作用，为脑血管疾病的靶向治疗提供了新思路。