作者Susan S.-C. Tai、Mary Bedner和Karen W. Phinney来自美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）分析化学部。该研究于2010年3月1日发表在《Analytical Chemistry》第82卷第5期上，题为“development of a candidate reference measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitamin d3 and 25-hydroxyvitamin d2 in human serum using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry”。这是一项原始研究，报告了一种用于测定人血清中25-羟基维生素D3（25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3）和25-羟基维生素D2（25-hydroxyvitamin D2, 25(OH)D2）的候选参考测量程序（reference measurement procedure, RMP）。

研究背景方面，维生素D存在两种主要形式，即维生素D3（vitamin D3）和维生素D2（vitamin D2），二者在体内均代谢为25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D, 25(OH)D）。血清中25(OH)D3和25(OH)D2的水平被认为是评估维生素D状态的最佳指标。维生素D缺乏可导致儿童佝偻病和成人骨质疏松，并与乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌及心血管疾病风险相关。临床实验室中常用的免疫分析法可能因交叉反应或对25(OH)D3和25(OH)D2响应不一致而产生偏差；液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）虽然选择性高，但可能受到具有相同质荷比的3-差向异构体（3-epimer）干扰。因此，作者开发并系统评价了一种同位素稀释液相色谱-串联质谱（isotope-dilution LC-MS/MS）候选参考测量程序，旨在为临床方法提供准确性基础和计量溯源性。

研究流程方面，该程序使用氘代化合物25(OH)D3-d3和25(OH)D2-d3分别作为25(OH)D3和25(OH)D2的内标（internal standard）。25(OH)D3参考化合物来自美国药典（United States Pharmacopeia, USP），25(OH)D2参考化合物来自Isosciences公司；经液相色谱/紫外吸收、热重分析和气相色谱顶空分析评价，25(OH)D3和25(OH)D2的纯度分别为99.40%±0.14%和95.41%±0.15%。校准溶液通过重量法配制，25(OH)D3工作标准溶液浓度范围为270–400 ng/g，25(OH)D2工作标准溶液浓度范围为240–350 ng/g。对于每批样品，从三种工作标准溶液中取两份不同体积的等分试样，加入相应内标，制成六个校准品，未标记与标记化合物的质量比范围为0.65–1.40。

样品前处理方面，25(OH)D3研究使用三名个体供体的血清材料（浓度分别为6.3、15.3和27.0 ng/g），25(OH)D2研究使用一名个体供体的血清材料（浓度约0.9 ng/g）。每个样品约2 g血清在50 mL玻璃离心管中精确称量，加入适量内标使分析物与内标质量比约为1:1，室温平衡1小时后，用约400 μL的0.1 g/mL碳酸盐缓冲液（pH 9.8±0.2）调节pH，然后以8 mL己烷-乙酸乙酯（50:50，体积比）进行液液萃取（liquid-liquid extraction），机械振摇10分钟，重复萃取一次，合并有机相，在45 °C下氮气吹干，残渣以120 μL甲醇复溶后用于LC-MS/MS分析。

色谱分离采用Zorbax SB-CN色谱柱（4.6 mm内径×25 cm，5 μm粒径），流动相为34%水/66%甲醇（体积比）等度洗脱，流速1 mL/min，柱温30 °C，进样体积10–20 μL。质谱采用大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）正离子模式和多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM），监测的离子对分别为m/z 401→383（25(OH)D3）、m/z 404→386（25(OH)D3-d3）、m/z 413→395（25(OH)D2）和m/z 416→398（25(OH)D2-d3）。针电流5 μA，温度350 °C。测量方案为先分析六个校准品，再分析样品，然后以相反顺序重复分析，校准曲线采用线性回归拟合。

方法验证方面，平衡时间实验显示，内标与血清在0.5小时即已达到完全平衡，因此选择1小时作为常规平衡时间。绝对回收率实验表明，25(OH)D3和25(OH)D2从血清中的绝对回收率分别为97%（CV 0.4%，n=5）和92%（CV 0.9%，n=5）。由于采用同位素稀释定量，绝对回收率低于100%不影响方法准确性。准确度通过向已知25(OH)D水平的血清中加入已知量的未标记25(OH)D进行回收率实验评价。25(OH)D3加入量约为8、16和38 ng/g三个浓度水平，25(OH)D2加入量约为8、16和24 ng/g三个浓度水平。25(OH)D3的平均回收率为100.1%–101.0%，25(OH)D2的平均回收率为99.0%–99.4%。

干扰评价方面，3-epi-25(OH)D3和3-epi-25(OH)D2具有与25(OH)D3和25(OH)D2相同的相对分子质量，仅在C3位羟基构型不同，色谱分离困难。作者考察了手性柱、C18柱和氰基柱（CN柱）等多种色谱柱，只有CN柱能实现25(OH)D3与3-epi-25(OH)D3的基线分离。在评估的所有成人血清材料中均检测到3-epi-25(OH)D3。由于3-差向异构体在婴儿中可占总25(OH)D的8.7%–61.1%，若不能实现色谱分离，质谱法可导致25(OH)D结果偏高。

精密度方面，对25(OH)D3三个浓度水平（约6.3、15.3和27.0 ng/g）和25(OH)D2一个浓度水平（约0.9 ng/g）进行了三批样品分析，每批含每个血清材料的三个平行样品。对于25(OH)D水平>1 ng/g，批内变异系数（coefficient of variation, CV）为0.1%–0.5%，批间CV为0.2%–0.6%；对于 ng/g的水平，批内CV为0.9%–2.9%，批间CV为2.0%。校准曲线线性良好，典型回归方程为y=0.98617x+0.00580（r=0.9997；标准误差=0.00623；n=12）。信噪比约3时，25(OH)D的检测限为柱上40 pg（约相当于浓度0.15 ng/g）。

测量不确定度评估遵循NIST指南和ISO测量不确定度表示指南。A类不确定度来自测量不精密度，通过方差分析判断批间差异是否显著；结果显示所有水平的p值均大于0.05，批间差异无统计学意义，因此以9个样品均值的标准差除以√9计算均值的标准差。B类不确定度包括参考化合物纯度不确定度（25(OH)D3为0.14%，25(OH)D2为0.15%）、称量不确定度（0.1%）以及样品制备和LC-MS/MS系统中未知系统误差与未检出干扰的1%允许量。合成标准不确定度后乘以包含因子k=2得到扩展不确定度（95%置信区间）。25(OH)D3三个浓度水平的相对扩展不确定度分别为2.1%、2.0%和2.0%，25(OH)D2为2.4%。

主要结论方面，该LC-MS/MS候选参考测量程序对血清25(OH)D3和25(OH)D2具有良好的准确度和精密度，且对干扰的敏感性低。25(OH)D3和25(OH)D2的加标回收率均接近100%，绝对回收率分别达97%和92%，批间CV在>1 ng/g水平为0.2%–0.6%。该方法成功实现了25(OH)D3和25(OH)D2与其各自3-差向异构体的色谱分离，避免了质谱法中常见的高估问题。检测限为柱上40 pg，相对扩展不确定度约为2.0%–2.4%。该候选参考测量程序满足国际标准化组织（ISO）15193对参考测量程序的要求，仅待实验室间验证研究完成后即可被检验医学溯源联合委员会（Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine, JCTLM）认可为正式参考测量程序。

该研究的科学价值在于提供了一个高准确度、低不确定度的血清25(OH)D测定方法，可用于为临床实验室的常规检测方法提供准确性基础，促进检测结果的计量溯源性。应用价值方面，NIST已使用该候选参考测量程序为一种新的人血清维生素D标准参考物质（standard reference material, SRM）中的25(OH)D3和25(OH)D2进行定值，该标准物质可用于临床实验室检测方法的准确性验证和质量控制。

该研究的亮点包括：第一，系统评价了3-差向异构体干扰问题，并通过CN色谱柱实现了基线分离，解决了质谱法测定25(OH)D的关键技术难题；第二，采用同位素稀释法定量，以氘代内标校正提取损失和基质效应，保证了方法准确度；第三，完整进行了方法验证，包括平衡时间、绝对回收率、加标回收率、精密度、检测限和不确定度评估；第四，该方法是目前少数符合ISO 15193要求的血清25(OH)D参考测量程序之一，具有重要的计量学意义。此外，研究还指出，免疫分析法可能因与维生素D其他代谢物交叉反应或对25(OH)D3和25(OH)D2响应不一致而存在局限性，而LC-MS/MS方法若不能分离3-差向异构体也会产生正偏差，这些观点对临床检测方法的选择和改进具有指导意义。