本研究发表于《BioMed Research International》期刊，于2019年5月16日正式发表。研究由包真真、黄艳丽、陈继宇、王正龙、钱江、徐季旸和赵宇程共同完成。通讯作者为徐季旸和赵宇程。作者单位包括江苏卫生健康职业学院药学院，以及中国药科大学生命科学与技术学院和江苏省中药药效与安全性评价重点实验室/天然药物活性组分与药效国家重点实验室。
二、 研究背景与目的
本研究属于分子生物学与基因表达分析领域，具体聚焦于实时定量聚合酶链式反应（Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR， RT-qPCR）技术中的内参基因（Reference Genes）验证问题。RT-qPCR是基因表达研究中一种高灵敏度、高特异性和高通量的关键技术。然而，该技术的准确性严重依赖于使用合适的内参基因对目标基因的表达量进行标准化（Normalization），以消除样本间RNA提取效率、反转录效率和加样误差等因素带来的技术性变异。传统上，一些基因如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin, ACTB）等常被默认为“看家基因”（Housekeeping Genes）而广泛使用。但大量研究表明，没有一种内参基因能在所有细胞类型、所有实验条件下保持恒定表达，其表达水平可能因组织、细胞、发育阶段或处理条件的不同而波动。使用不稳定的内参基因会导致数据标准化错误，从而得出误导性结论。
RAW264.7细胞是一种源自小鼠肿瘤的巨噬细胞系，在免疫学、微生物学和炎症研究中被广泛应用。尽管其使用广泛，但在该细胞系中，尤其是在不同药物或刺激处理条件下，系统性地筛选和验证稳定内参基因的研究尚属空白。因此，本研究的目的是在RAW264.7细胞中，系统评估十种常用候选内参基因在不同处理条件下的表达稳定性，旨在为该细胞系的基因表达研究确定最可靠的内参基因组合，为未来相关研究提供标准化依据。
三、 详细研究流程
本研究流程严谨，主要包括以下几个步骤：
1. 细胞培养与处理： 研究对象为RAW264.7小鼠巨噬细胞。细胞在标准条件下培养。为模拟不同病理生理或药理刺激，研究设置了多种处理条件，每种条件设置三个生物学重复。处理包括： * 高糖（High-glucose, HG）： 50 mM， 100 mM， 200 mM。 * 过氧化氢（H₂O₂）： 50 μM， 100 μM， 200 μM。 * 脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）： 0.1 μg/mL， 0.5 μg/mL， 1 μg/mL。 * 氯化钴（Cobalt chloride, CoCl₂）： 50 μM， 100 μM， 200 μM。 * 棕榈酸（Palmitic acid, PA）： 50 μM， 100 μM， 200 μM。 此外，设置未经任何处理的细胞作为对照组。这些处理涵盖了氧化应激、炎症、缺氧模拟（CoCl₂）和代谢应激等多种生物学过程，确保了评估条件的广泛性。
2. 候选内参基因与引物设计： 基于文献中高频使用的原则，研究选择了十个候选内参基因：ACTB, GAPDH, 核糖体蛋白L4（Ribosomal protein L4, RPL4）, 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶-1（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase-1, HPRT1）, 亲环蛋白A（Cyclophilin A, PPIA）, 细胞色素c-1（Cytochrome c-1, CYC1）, 羟甲基胆色烷合酶（Hydroxymethylbilane synthase, HMBS）, 真核翻译延伸因子1α1（Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, EEF1A1）, β-葡萄糖醛酸苷酶（Glucuronidase β, GUSB）, 乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase A, LDHA）。所有引物均经过专业设计，确保扩增片段长度在100-150 bp，GC含量在40%-60%，并避免引物二聚体形成。引物特异性通过PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（显示单一条件）和溶解曲线分析（显示单一峰）进行了验证。
3. RNA提取与cDNA合成： 使用RNAiso Plus总RNA提取试剂盒从处理组和对照组细胞中提取总RNA。为确保RNA质量，使用DNase I消化去除基因组DNA污染。通过测量OD260/OD280比值（介于1.8-2.0之间）和琼脂糖凝胶电泳评估RNA的纯度和完整性。使用HiScript® Q RT SuperMix for qPCR试剂盒，以0.5 μg总RNA为起始量进行cDNA合成，以保证实验精度。合成的cDNA保存于-20°C备用。
4. 实时定量PCR（RT-qPCR）分析： 使用LightCycler 480系统进行RT-qPCR反应。反应体系包含cDNA模板、正反向引物以及SYBR Green预混液。每个样本均设置复孔。通过该步骤获得每个候选基因在不同样本中的循环阈值（Cycle threshold, Ct）值，Ct值反映了基因的起始表达量，Ct值越低表示表达水平越高。
5. 数据分析与稳定性评估： 这是本研究的核心分析部分。研究并未依赖单一算法，而是综合运用了三款国际公认的内参基因稳定性分析软件，从不同角度进行评估，以增加结论的可靠性： * geNorm： 该算法通过计算基因表达稳定值M来衡量内参基因的稳定性。M值基于所有基因对之间的配对变异计算得出，M值越低表示基因表达越稳定。此外，geNorm还能通过计算配对变异值Vn/n+1来确定最优的内参基因数量，当V值小于0.15时，认为增加更多内参基因对提高标准化准确性贡献不大。 * NormFinder： 与geNorm类似，NormFinder也通过计算稳定性值M来对基因进行排序，M值最小的基因最稳定。该算法特别考虑了组内和组间的变异，对于识别样本组间差异最小的基因更为敏感。 * BestKeeper： 该算法基于Excel，通过计算候选基因Ct值的标准差（Standard Deviation, SD）和变异系数（Coefficient of Variance, CV）来评估稳定性。SD和CV值越小，表明基因表达波动越小，越稳定。通常将SD > 1.5的基因视为不稳定而排除。
四、 主要研究结果
1. 候选基因的表达水平差异： 对所有样本的Ct值分析显示，十个候选内参基因的表达水平存在显著差异，平均Ct值范围从15到30不等。其中，EEF1A1、GAPDH和ACTB是表达量最高的三个基因（Ct值较低），而CYC1是表达量最低的基因（Ct值接近30）。从Ct值的分布范围（箱线图的“箱子”和“触须”长度）来看，LDHA、ACTB和HMBS的表达范围相对较窄，提示其表达可能较为稳定；而RPL4的Ct值范围很大，表明其表达波动剧烈，可能不适合作为内参基因。
2. 不同软件的内参基因稳定性排名： 综合三种软件的分析结果，发现不同算法给出的稳定性排名存在一定差异，这凸显了使用多种方法交叉验证的必要性。 * geNorm分析： 结果显示，最稳定的基因因处理条件不同而异，表明内参基因的稳定性确实受实验条件影响。例如，在对照组中，GAPDH最稳定，RPL4最不稳定；而在0.5 μg/mL LPS处理组中，HPRT1最稳定，PPIA最不稳定。尽管如此，整体趋势显示，GAPDH、HMBS和HPRT1在多种条件下表现相对稳定。 * NormFinder分析： 在对照组中，稳定性排名为：GAPDH > HMBS > CYC1 > GUSB > ACTB > HPRT1 > EEF1A1 > PPIA > LDHA > RPL4。这与geNorm对对照组的结果基本一致。值得注意的是，在某些条件下（如200 μM PA处理），CYC1和HPRT1具有相同的M值，表明它们稳定性相当。HMBS基因在多种条件下显示出最低的M值，表现突出。 * BestKeeper分析： 该分析基于SD和CV值。根据其标准（SD > 1.5的基因不稳定），在50 μM CoCl₂处理组中PPIA（SD=1.53）、在200 μM CoCl₂处理组中LDHA（SD=1.56）以及在对照组中RPL4（SD=2.50）被排除在稳定基因之外。分析结果显示，GUSB和HMBS频繁出现在最稳定基因之列，而EEF1A1和RPL4则常被列为最不稳定的基因。
3. 综合稳定性评估与最优内参基因确定： 尽管三种算法的具体排名有所出入，但通过整合所有结果，可以得出明确的结论。HMBS是唯一一个被所有三种分析方法一致认定为高度稳定的基因。 CYC1在NormFinder和geNorm分析中也表现出很高的稳定性。相反，RPL4和PPIA在多项分析中排名垫底，表现最不稳定。因此，本研究得出结论：在RAW264.7细胞中，CYC1和HMBS是表达最稳定、最适合用于基因表达标准化的内参基因，而RPL4和PPIA是最不稳定的，不适合作为内参基因。
4. 最优内参基因数量的确定： 使用geNorm软件计算配对变异值Vn/n+1。以0.15为临界值，结果显示：在对照组、所有浓度的H₂O₂处理组、所有浓度的LPS处理组、100 μM CoCl₂处理组和200 μM PA处理组中，V2/3值小于0.15，表明使用两个最稳定的内参基因进行标准化已足够。然而，在200 μM CoCl₂和100 μM PA处理条件下，需要三个内参基因（V3/4 < 0.15）。而在所有浓度的高糖处理组、50 μM CoCl₂和50 μM PA处理组中，V4/5值仍高于0.15，提示在这些特定条件下，使用四个内参基因可能能进一步提高标准化的准确性。
五、 研究结论与价值
本研究系统评估了RAW264.7细胞在多种刺激条件下十个常用内参基因的表达稳定性。主要结论是：CYC1和HMBS是RAW264.7细胞中最稳定的内参基因组合，推荐用于该细胞系的基因表达RT-qPCR研究；而RPL4和PPIA稳定性差，应避免使用。 此外，研究指出在大多数实验条件下，使用两个内参基因足以实现准确标准化，但在某些特定处理（如高糖）下，可能需要三个甚至四个内参基因以获得最佳效果。
本研究的科学价值在于：首次为RAW264.7这一广泛使用的巨噬细胞模型提供了经过严格验证的内参基因选择方案，填补了该领域的空白。其应用价值巨大，能够直接指导未来利用RAW264.7细胞进行基因表达研究的科学家选择正确的内参基因，从而从根本上提高RT-qPCR数据的可靠性和可比性，避免因内参基因选择不当而导致的研究结论偏差。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究在讨论部分对比了本研究结果与既往文献的异同。例如，指出GAPDH在本研究中被geNorm分析认定为稳定基因，这与在小鼠子宫细胞和J774A.1巨噬细胞中的一些报道一致，但与许多其他认为GAPDH不稳定的研究相左，进一步说明了内参基因稳定性的情境依赖性。同时，研究提到RPL4和PPIA在本研究中表现不佳，但既往有研究认为它们在特定条件下稳定，这种差异突显了在不同细胞系统和实验方案中进行独立验证的必要性。这些讨论增强了研究的深度和学术对话性。