一项发表于《Carbohydrate Polymers》的研究提出了一种用于细胞封装与递送的可注射温敏壳聚糖水凝胶的理性配方设计策略。该研究由法国巴黎科学与文学大学（PSL University）巴黎高等物理化工学院（ESPCI Paris）的Laurent Corté及其团队主导完成。研究于2021年11月2日在线发表，论文标题为《用于细胞封装和递送的可注射温敏壳聚糖基水凝胶的理性配方设计》。作者包括Phuong Anh Dang、Carla Palomino-Durand等人，他们来自多个研究机构，包括ESPCI Paris的分子与大分子化学与材料实验室（C3M）和赛尔齐巴黎大学（CY Cergy Paris Université）的细胞外基质-细胞关系研究团队（ERRMECE）。

这项研究属于生物材料和组织工程领域。可注射的细胞负载水凝胶在细胞治疗中作为递送载体或基质引起了极大的兴趣，因为它们能以微创方式施用于难以触及的脆弱组织，为注射的细胞提供临时支架，确保其活力并刺激其活性。该领域的核心挑战在于设计一种体系，其在注射前后保持液态，接触生理条件（体温37°C、pH值7.4及生理渗透压约300 mOsm·L⁻¹）时能快速凝胶化。壳聚糖（chitosan, CS）是一种由D-氨基葡萄糖（D-glucosamine）和N-乙酰-D-氨基葡萄糖组成的线性共聚物，因其生物可降解性和生物相容性，是开发细胞递送基质的理想材料。然而，壳聚糖在中性pH值下的低溶解度曾是其应用的主要障碍。虽然通过添加β-甘油磷酸盐（beta-glycerophosphate, βGP）可制备在室温下保持液态、在体温下凝胶的溶液，但达到生理pH所需的高盐浓度会导致渗透压过高，产生细胞毒性。为解决此问题，已有研究尝试用其他盐类（如磷酸氢二铵ammonium hydrogen phosphate, AHP）部分或完全替代βGP。然而，目前仍缺乏一个能独立控制pH值和渗透压，从而精确调控凝胶化动力学和细胞相容性的通用平台，而这是优化水凝胶粘弹性和微观结构以适应细胞生长的关键。本研究旨在通过使用βGP和AHP两种磷酸盐混合物，建立一个理性配方设计平台，实现体系pH值和渗透压的独立调节。

研究的工作流程分为几个核心步骤。第一步是配方设计与优化。研究者使用βGP和AHP的混合磷酸盐体系，在4°C下对壳聚糖溶液进行pH滴定。核心变量是两种盐与D-氨基葡萄糖单体的摩尔比（[βGP]/[NH₂] 和 [AHP]/[NH₂]）。通过固定[βGP]/[NH₂]并改变[AHP]/[NH₂]，测量pH值变化，并构建了在目标pH值（7.0-7.4）下，两种盐摩尔比的等pH线性关系图。研究发现，只要固定好盐与氨基单体的比例，pH值就与壳聚糖浓度无关。同时，通过独立测量各组分的渗透压贡献，建立了总渗透压与各组分浓度的线性方程，从而绘制出等渗透压曲线。通过在同一坐标系中叠加等pH曲线和等渗透压曲线，即可唯一确定满足特定pH（如7.4）和生理渗透压（300 mOsm·L⁻¹）的配方。第二步是凝胶化动力学研究。采用试管倒置法和流变学方法，系统测量了在固定pH值下，不同盐比或固定生理条件下，不同壳聚糖浓度的配方在不同温度下的凝胶化时间。结果发现凝胶化时间随温度升高而急剧缩短，并遵循一个临界幂律模型（t_gel = k(T - T_c)^γ），即存在一个临界温度T_c，高于此温度时溶胶-凝胶转变才会发生。第三步是体外细胞实验。研究者选择了一种等渗配方（CS/βGP/AHP, 300 mOsm·L⁻¹）和一种高渗配方（CS/βGP, 600 mOsm·L⁻¹）进行比较，固定壳聚糖浓度为0.8 wt%，pH为7.4。他们将小鼠颅骨前成骨细胞（MC3T3-E1）和人牙龈成纤维细胞（HGF）以10⁶ cells·mL⁻¹的密度分散在液态配方中，再通过37°C孵育使其凝胶化以实现封装。在封装后1小时和24小时，通过活/死细胞染色实验（Live/Dead assay）评估细胞活力和分布，并用阿尔玛蓝检测法（AlamarBlue assay）评估细胞代谢活性。第四步是水凝胶的微观结构和力学性能表征。对于具有生理pH和渗透压、但壳聚糖浓度不同的配方（0.5 wt%和0.8 wt%），研究团队使用激光共聚焦扫描显微镜观察了用荧光染料标记的凝胶微观结构，并通过定制的形态学筛算法对孔径分布进行定量分析。同时，使用旋转流变仪在37°C下进行时间扫描，测量水凝胶的储存模量（G’）和损耗模量（G”）。

研究的主要结果与结论如下。首先，在配方设计方面，研究成功证明通过简单改变[βGP]/[NH₂]和[AHP]/[NH₂]两个摩尔比，可以独立且精细地调节体系的pH值和渗透压。这为制备在壳聚糖浓度从0.4 wt%到0.9 wt%范围内，均能同时满足生理pH（7.4）和生理渗透压（300 mOsm·L⁻¹）的可注射溶液提供了可能。例如，在0.8 wt%的CS浓度下，达到生理条件的配方摩尔比为[βGP]/[NH₂] = 1.5和[AHP]/[NH₂] = 1.4。第二，在凝胶化动力学方面，揭示了凝胶化时间与温度之间的临界幂律关系。所有符合生理条件的配方在室温（约21°C）下均能保持液态超过2小时，为细胞分散和操作提供了充裕的时间；而在37°C体温下，凝胶可在2分钟内快速形成，有效防止细胞被体液冲散。研究还发现，通过增加CS浓度或提高AHP/βGP比例，可以降低临界温度T_c，加快凝胶化。第三，在细胞相容性评估中，等渗的CS/βGP/AHP水凝胶展现出比高渗的CS/βGP水凝胶更优越的性能。封装1小时后，两种配方的两种细胞活性均高达90%以上。但封装24小时后，MC3T3-E1细胞在等渗配方中的存活率（78%）显著高于高渗配方（52%），且其单细胞代谢活性也更高。HGF细胞则对两种渗透压条件均表现出较好的耐受性，这与其已知的抗渗透压休克能力相符。最终，所有封装细胞呈圆形表型，表明壳聚糖基质本身缺乏细胞粘附位点，这为后续引入生物功能化策略（如接枝粘附肽）指明了方向。第四，水凝胶的微观结构与力学性能表现出对壳聚糖浓度的依赖性。当CS浓度从0.5 wt%增加到0.8 wt%时，凝胶的孔隙率从75%降至63%，大孔的特征尺寸从30 μm降至15 μm。同时，凝胶的力学强度也随之增加，储存模量G’在37°C下凝胶化6小时后，从约60 Pa增加到约300 Pa。这些结果表明，通过调节壳聚糖浓度，可以在不牺牲细胞相容性的前提下，定制水凝胶的微观结构和力学性能，以满足不同软组织的修复需求，例如其较低的力学强度范围非常适用于脑组织等极软组织的修复。

该研究的主要亮点在于提出了一种通用且理性的配方设计策略。其核心创新是通过引入AHP作为第三种成分，解耦了pH和渗透压这两个在传统CS/βGP体系中相互关联的关键参数。研究建立的等pH和等渗透压线图，为各种应用场景下快速、准确地筛选配方提供了一个直观的平台。此外，研究首次揭示了这类体系的凝胶化时间遵循临界幂律行为，并定义了临界凝胶化温度，这为理解凝胶化机理和精确控制凝胶化过程提供了新的物理视角。

这项研究的科学价值在于提供了一种系统性的方法学，解决了温敏壳聚糖水凝胶配方中的核心瓶颈问题——即如何同时实现生理相容性和可控的凝胶化行为。其应用价值是显而易见的，该平台不仅适用于本研究使用的壳聚糖类型，还可推广至不同分子量、脱乙酰度甚至功能化的壳聚糖衍生物，为开发用于多种细胞治疗和组织再生的即用型、可注射细胞载体铺平了道路。