关于普马拉病毒利用巨胞饮作用和网格蛋白依赖性内吞作用进行感染性入侵的学术研究报告
本研究由Sandy Bauherr, Filip Larsberg, Annett Petrich, Hannah Sabeth Sperber, Victoria Klose-Grzelka, Madlen Luckner, Walid Azab, Matthias Schade, Chris Tina Höfer, Maik Joerg Lehmann, Peter T. Witkowski, Detlev H. Krüger, Andreas Herrmann, Roland Schwarzer等研究人员完成。他们主要来自德国的研究机构，包括柏林洪堡大学分子生物物理系、柏林洪堡大学分子寄生虫学系、柏林夏里特医学院病毒学研究所、柏林自由大学病毒学中心等。该研究发表于2020年7月的《Journal of Virology》（第94卷，第14期，文章编号e00184-20）。
一、 学术背景与研究目的
本研究隶属于病毒学与细胞生物学交叉领域，重点关注汉坦病毒科病毒的细胞入侵机制。汉坦病毒是一类新发的人畜共患病原体，可引发两种具有高致死率的严重疾病：肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（HCPS），死亡率最高可达50%。尽管已知汉坦病毒的入侵依赖于内吞作用和囊泡酸化，但其具体的内化机制在不同病毒种间存在差异。例如，旧世界汉坦病毒（如汉滩病毒，HTNV）主要利用网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis, CME）进入细胞，而新世界汉坦病毒（如安第斯病毒，ANDV）则通过网格蛋白非依赖性途径入侵。近年来，越来越多的证据表明，巨胞饮作用（macropinocytosis, MPC）可能是汉坦病毒入侵的另一潜在途径。
基于此背景，本研究旨在全面阐明在欧洲最为流行的致病性汉坦病毒——普马拉病毒（Puumala virus， PUUV）进入哺乳动物细胞的具体机制和所依赖的宿主因子。研究重点关注CME和MPC两种途径在PUUV感染性入侵中扮演的角色，并探讨病毒本身是否能够调控这些细胞过程以促进自身的进入。
二、 研究流程与实验方法
本研究采用了一套多层次、互补的实验策略来验证假设，主要流程包含五个部分：
第一部分：广谱及特异性内吞途径抑制剂的药理学筛选 研究首先在非洲绿猴肾细胞（Vero E6细胞）中使用一系列已知的化学抑制剂，评估其对PUUV感染的影响。研究使用了9种化合物，它们分别针对不同的细胞内部化过程或特定内吞途径： 1. 广谱作用抑制剂：包括破坏微管的诺考达唑（nocodazole）、抑制肌动蛋白聚合的细胞松弛素D（cytochalasin D）、抑制发动蛋白依赖的膜泡分裂的Dynasore，以及消耗胆固醇以破坏脂筏的甲基-β-环糊精（MβCD）。这些药物影响多种内吞途径及后续的胞内运输。 2. 特异性途径抑制剂：包括抑制CME的氯丙嗪（chlorpromazine， CPZ）；以及两种通过不同机制抑制MPC的药物——抑制钠氢交换器的EIPA（ethylisopropyl amiloride）和抑制特定蛋白激酶C亚型的Rottlerin。 3. 酸化抑制剂：包括巴弗洛霉素A（bafilomycin A， 抑制v-ATP酶）和氯化铵（NH4Cl， 缓冲细胞内酸化），用于阻断依赖pH的病毒膜融合过程。
在正式感染实验前，所有抑制剂的有效浓度均通过功能性滴定实验预先确定，以确保能有效抑制目标通路（如通过FITC-葡聚糖摄取评估MPC抑制，通过转铁蛋白摄取评估CME抑制）且不产生明显的细胞毒性（细胞活力>80%）。随后，细胞在抑制剂预处理1小时后，用PUUV（感染复数MOI=1）感染48小时。病毒感染水平通过反转录定量PCR（RT-qPCR）检测病毒S节段RNA拷贝数来评估。
为了区分抑制剂是影响病毒进入还是病毒复制后期步骤，研究进一步优化了实验方案。将感染时间缩短至24小时以减少次级感染的影响，并通过改变药物处理的时间窗口来精确靶向病毒生命周期的不同阶段：仅在感染最初2小时处理（主要影响进入）、在整个24小时感染期处理（影响进入和复制）、或在感染开始2小时后才进行处理（主要影响复制）。这一精细设计对于确认特定途径在病毒进入过程中的作用至关重要。
第二部分：基因沉默验证巨胞饮作用的重要性 为了克服药物可能存在的脱靶效应，研究采用了RNA干扰技术进行独立验证。研究靶向敲低了巨胞饮作用的关键调节因子——p21激活激酶1（PAK-1）。首先，通过剂量梯度实验确定能够有效降低PAK-1蛋白表达并抑制FITC-葡聚糖流体相摄取的最低有效siRNA浓度（20 nM）。随后，用此浓度的PAK-1特异性siRNA转染Vero E6细胞48小时，然后感染PUUV（MOI=1）24小时，最后通过RT-qPCR检测病毒感染水平，并与使用非靶向siRNA的对照组进行比较。
第三部分：病毒粒子标记与活细胞成像 为了直接观察病毒粒子的内化过程，研究建立了一种基于脂质染料的活病毒荧光标记方法。将提纯的PUUV病毒颗粒与脂溶性荧光染料DiI或DiD共同孵育，然后通过尺寸排阻色谱去除未结合的染料。这种标记方法被证明不影响病毒的感染性。标记的病毒被用于以下实验： 1. 活细胞动态追踪：将表达微管结合蛋白Tau-YFP的Vero E6细胞与DiI标记的病毒共孵育，使用共聚焦显微镜进行活细胞成像（每2.9秒采集一帧），并利用ImageJ软件进行病毒粒子追踪，计算其运动速度。 2. 相关光电子显微镜（CLEM）验证：为了确认荧光斑点确实对应病毒粒子而非染料聚集体，研究将感染了标记病毒的细胞先在共聚焦显微镜下定位荧光信号区域，然后对同一区域进行扫描电镜（SEM）或透射电镜（TEM）成像，将荧光图像与超微结构图像进行关联分析。
第四部分：病毒粒子与巨胞饮囊泡的共定位分析 为了提供病毒通过巨胞饮途径进入细胞的直接证据，研究进行了共定位实验。将Vero E6细胞同时暴露于DiI/DiD标记的PUUV和作为巨胞饮标志物的高分子量FITC-葡聚糖。感染不同时间点（如5分钟、30分钟）后，固定细胞，并通过免疫荧光染色检测病毒糖蛋白GC。最后，使用共聚焦显微镜成像，并通过ImageJ的“ComDet”插件对病毒粒子（DiI/DiD信号）与巨胞饮囊泡（FITC-葡聚糖信号）的共定位进行定量分析，计算共定位病毒粒子的百分比。
第五部分：病毒感染对巨胞饮作用的促进作用探索 基于某些病毒会主动刺激内吞作用的报道，本研究探索了PUUV感染是否会影响宿主细胞的巨胞饮活性。 1. 肌动蛋白聚集观察：在PUUV感染72小时后，用罗丹明-鬼笔环肽染色观察细胞内的丝状肌动蛋白（F-actin）分布，并同时通过免疫荧光检测病毒核蛋白N。 2. 流体相摄取定量：为了检测病毒结合本身是否能立即刺激巨胞饮，研究将细胞在4°C下与高滴度PUUV（MOI=10）孵育30分钟，使病毒结合但不内化。洗去未结合的病毒后，将细胞转移至37°C，加入FITC-葡聚糖孵育30分钟以标记新形成的巨胞饮囊泡。通过流式细胞术定量细胞内的平均荧光强度，比较病毒感染组与模拟感染对照组的葡聚糖摄取量。
三、 主要研究结果
1. 药理学抑制表明CME和MPC是PUUV感染的关键途径。 广谱抑制剂（诺考达唑、细胞松弛素D、Dynasore、MβCD）均能导致感染水平出现中度但显著的下降（约30%），这与PUUV通过内吞途径进入细胞的假设一致。更重要的是，特异性抑制剂CPZ（CME抑制剂）、EIPA和Rottlerin（MPC抑制剂）均能强烈且极显著地降低PUUV感染，使感染水平降至对照的25%左右，表明这两种途径都是PUUV入侵Vero E6细胞的主要途径。酸化抑制剂巴弗洛霉素A和氯化铵也显著降低了感染，证实了pH依赖的膜融合对PUUV感染至关重要。时序抑制剂实验进一步确认，只有当CPZ、EIPA或Rottlerin在感染最初2小时（进入阶段）存在时，才能显著抑制感染；而在感染2小时后再添加则对感染水平无影响。这有力地证明这些抑制剂的作用靶点确实是病毒的进入过程，而非后续的复制。
2. RNA干扰敲低PAK-1显著降低PUUV感染。 使用20 nM PAK-1特异性siRNA成功敲低了Vero E6细胞中PAK-1的表达，并抑制了FITC-葡聚糖的摄取。与药理学结果一致，PAK-1敲低导致PUUV感染的病毒RNA拷贝数比使用非靶向siRNA的对照组显著降低约80%。这一独立于药物实验的基因水平证据，进一步证实了巨胞饮作用在PUUV入侵中的关键作用。
3. 脂质标记病毒粒子显示与巨胞饮标志物共定位。 活细胞成像显示，DiI标记的病毒粒子能以约1000 nm/s的平均速度沿微管网络运动。CLEM分析证实，荧光显微镜下观察到的红色斑点与电镜下的球形病毒粒子（直径约100 nm）在空间上完全对应，排除了染料伪影的可能性。共定位实验显示，早在感染后5分钟，就有显著比例的DiI/DiD标记的病毒粒子与FITC-葡聚糖阳性的囊泡共定位；到感染后30分钟，共定位比例进一步显著增加，单个细胞中超过30%的病毒粒子位于巨胞饮囊泡内。免疫荧光染色也证实了病毒GC蛋白与葡聚糖标记的囊泡共定位。值得注意的是，仍有部分病毒粒子不与葡聚糖共定位，这可能反映了病毒已离开巨胞饮途径，或者表明存在CME等其他内吞途径的并行利用。
4. PUUV感染可能刺激肌动蛋白聚集并增强巨胞饮活性。 免疫荧光观察发现，在感染72小时后，高表达病毒N蛋白的细胞区域，尤其是核周区域，往往伴随着丝状肌动蛋白（F-actin）的异常聚集，且该区域也靠近微管组织中心。更重要的是，流式细胞术分析表明，与仅仅在4°C结合病毒的细胞相比，经PUUV结合并随后在37°C孵育的细胞，其FITC-葡聚糖的摄取量出现轻微但统计上显著的增加。这提示PUUV与细胞受体的结合可能触发了某种信号，促进了巨胞饮活性，从而可能有利于病毒自身的内部化。
四、 研究结论与价值
本研究综合运用药理学抑制、基因敲低、活细胞成像、超微结构关联和功能分析等多种技术，首次全面、系统地证实了旧世界汉坦病毒PUUV利用网格蛋白介导的内吞作用（CME）和巨胞饮作用（MPC） 作为其进入哺乳动物细胞、建立生产性感染的两个关键并行的细胞通路。研究不仅证明了抑制这两种途径能有效阻断感染，还通过直接可视化展示了病毒粒子进入巨胞饮囊泡的过程。
其科学价值在于： 1. 深化了对汉坦病毒入侵机制的理解：将巨胞饮作用确立为PUUV的一个重要入侵途径，丰富了汉坦病毒细胞生物学知识，表明不同汉坦病毒种可能广泛地利用MPC。 2. 揭示了病毒与宿主的动态互作：研究发现PUUV感染可能导致肌动蛋白重组，并且病毒结合可能触发巨胞饮活性的增强。这提示PUUV可能不仅被动地利用现有细胞通路，还能主动“劫持”或刺激细胞机制以促进其自身的内化，这与其他一些利用巨胞饮的病毒（如埃博拉病毒、丝状流感病毒）的报道有相似之处，可能代表了一种跨病毒科的共通策略。 3. 为抗病毒策略提供了新靶点：明确了CME和MPC作为PUUV感染的关键门户，为开发针对病毒进入阶段的广谱或特异性抗汉坦病毒药物（例如，靶向巨胞饮关键调控因子）提供了潜在的理论依据和干预靶点。 4. 建立了有效的技术方法：成功建立并验证了适用于汉坦病毒的脂质染料标记和活细胞追踪技术，以及相关的CLEM流程，为未来研究汉坦病毒和其他囊膜病毒的入侵和胞内运输动力学提供了有用的工具。
五、 研究亮点
六、 其他有价值内容
研究在讨论部分提出了一个有趣的关联：已知汉坦病毒的主要细胞受体是整合素，而整合素信号通路与巨胞饮作用的激活在细胞迁移等过程中存在机制上的联系。作者指出，未来的研究需要进一步探讨整合素受体信号与PUUV触发的巨胞饮促进作用之间是否存在直接关联，这将有助于更深入地理解病毒入侵的起始信号事件。此外，研究也指出，需要在PUUV的主要体内靶细胞——内皮细胞中进一步验证这些发现，以确认其在生理相关环境下的普遍性。