学术研究报告：基于多酶介导动态交联的全天然水凝胶用于快速组织填充与修复
作者、机构与发表信息
本研究的主要作者为 Yue Liao, Aoyuan Fan, Zonghui Zhao, Yuxi Zhang, Yinghui Shang, Xinzhi Li, Rui Yue, Qigang Wang 和 Qing Wu。其中，通讯作者为 Rui Yue, Qigang Wang 和 Qing Wu。 作者团队来自多个研究机构，包括同济大学生命科学与技术学院、上海市第四人民医院、上海东方医院、中国三峡大学基础医学院等。这项研究成果以题为《Multienzyme-mediated dynamic cross-linking of all-natural hydrogels with high adhesion and redox modulation for rapid tissue filling and repair》的论文形式，发表在美国化学会旗下的顶级期刊 Journal of the American Chemical Society (JACS) 上。根据文末信息，该论文于2026年1月22日接收，并于同年4月30日修订后接受。
研究背景与目的
本研究隶属于生物材料、组织工程和再生医学交叉领域，核心目标是开发一种适用于软组织填充与修复的先进水凝胶材料。皮肤、肌肉和软骨等软组织的损伤通常伴随不规则缺损和有限的自身再生能力，临床上亟需能够恢复结构完整性和生理功能的填充材料。可注射水凝胶因其具有类似细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）的亲水网络结构，并能通过微创方式输送和原位快速凝胶化，在软组织填充领域展现出独特优势。然而，现有的可注射水凝胶普遍存在局限：物理水凝胶机械强度和结构稳定性不足；而不可逆的化学交联水凝胶在动态载荷下易发生脆性断裂，且往往依赖外部引发剂或自由基引发，限制了其体内应用的安全性。
受生物体内酶介导的交联和代谢调控机制启发，例如赖氨酰氧化酶（Lysyl Oxidase）催化胶原/弹性蛋白交联和转谷氨酰胺酶（Transglutaminase）催化异肽键形成，本研究团队提出了一种新的策略：利用天然多酶级联催化体系，在生理条件下实现全天然多糖水凝胶的快速、动态、原位形成。该研究旨在克服传统水凝胶的缺点，开发一种无需外部引发剂、无自由基参与、无需化学预修饰的生物安全性高、且能同时提供机械适应性和生化微环境调节功能的智能水凝胶体系，并将其应用于具有挑战性的骨关节炎（Osteoarthritis, OA）治疗。
详细研究流程与方法
本研究包含材料设计与表征、水凝胶性能系统评估、体外生物功能验证及体内治疗效果评价等多个紧密衔接的环节。
第一部分：多酶动态交联策略的构建与水凝胶形成机制验证
首先，研究团队设计了一个由半乳糖氧化酶（Galactose Oxidase, GAO）和过氧化氢酶（Catalase, CAT）组成的级联催化系统。他们选择天然半乳甘露聚糖（Galactomannan）作为凝胶前体和酶促底物。在半乳甘露聚糖的分子结构中，α-1，6-连接的半乳吡喃糖侧链上的C6羟基可被GAO特异性氧化生成活性醛基。同时，体系中的CAT可以即时分解GAO催化过程中产生的过氧化氢（H₂O₂），避免其细胞毒性。
研究流程如下： 1. 底物筛选与氧化验证：研究比较了四种不同半乳糖/甘露糖（G/M）比例的半乳甘露聚糖胶（葫芦巴胶、瓜尔胶、刺云实胶、刺槐豆胶）在GAO/CAT催化下与乙二醇壳聚糖（Glycol Chitosan， CHT）形成水凝胶的能力。通过试管倒置法，他们发现除葫芦巴胶外，其余三种均可形成稳定的水凝胶。 2. 醛基生成表征：为了探究凝胶化机制，研究人员利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振氢谱（¹H NMR）对酶促氧化后的多糖进行分析。FTIR光谱显示，瓜尔胶、刺云实胶和刺槐豆胶在1730 cm⁻¹处出现了新的醛基特征吸收峰，而葫芦巴胶则无此峰。¹H NMR进一步证实了醛基的生成。通过盐酸羟胺滴定法量化醛基取代度，发现瓜尔胶、刺云实胶和刺槐豆胶的醛基取代度较高（10.2%， 8.8%， 9.5%），而葫芦巴胶极低（1.0%）。这解释了葫芦巴胶无法凝胶的原因——其过高的半乳糖含量导致结构过于致密，阻碍了GAO对C6羟基的催化访问。 3. 席夫碱交联证实：将氧化后的半乳甘露聚糖与CHT混合后，FTIR光谱显示1730 cm⁻¹处的醛基峰消失，同时在1650 cm⁻¹处出现亚胺键（C=N）的特征峰，证实了醛基与氨基之间形成了动态的席夫碱（Schiff-base）交联，这是水凝胶网络形成的化学基础。 4. 初步力学性能评估：对成功制备的三种水凝胶进行压缩测试，结果显示它们均具有较高的压缩断裂应变（75.5% - 97.4%）和压缩强度（289.3 - 403.6 kPa），证明了该策略制备的全天然多糖水凝胶具备良好的力学潜力。
基于以上结果，研究选择瓜尔胶作为代表性多糖，对其形成的复合水凝胶（记为GC@GAO/CAT hydrogel）进行深入系统的研究。
第二部分：GC@GAO/CAT水凝胶的物理化学与机械性能表征
此部分旨在全面评估水凝胶作为组织填充材料的物理化学和机械适应性。 1. 凝胶动力学与流变学：通过流变学测试，研究了温度和酶含量对凝胶时间的影响。在生理温度（37°C）和优化后的GAO/CAT浓度（7.2 U/770 U）下，凝胶时间可缩短至11秒，实现了快速原位凝胶化。而在室温（25°C）下凝胶时间较长（1030秒），这保证了材料在注射前具有良好的可操作性。 2. 微观形貌与孔隙结构：使用扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶的微观结构。发现随着瓜尔胶浓度从0.10%增加到0.50% （w/v），水凝胶的平均孔径从约42微米减小到约5微米，表明可通过前体浓度调节网络致密程度。有趣的是，高浓度水凝胶中观察到了由CAT催化分解H₂O₂产生的氧气微泡聚集形成的大孔（约35微米），构成了分级孔结构。 3. 可调的力学性能：系统测试了不同瓜尔胶和CHT浓度下水凝胶的压缩模量。结果显示，压缩模量可在0.42至4.99 kPa范围内进行调节，以满足不同组织的填充需求。选定浓度（0.50%瓜尔胶， 1.30% CHT）的水凝胶在循环压缩测试中表现出有效的能量耗散能力。 4. 剪切稀化与自修复行为：流变测试证实，该水凝胶具有显著的剪切稀化特性，其粘度随剪切速率增加而急剧下降，保证了其优异的可注射性。通过交替阶跃应变测试，证实了水凝胶具有快速（数秒内）且可循环（10次以上）的自修复能力，这归功于动态席夫碱键在力作用下的可逆断裂与重组。宏观自愈合实验也显示了被切割的水凝胶碎片在37°C下能重新融合成完整形状。 5. 润滑性能：摩擦学测试表明，与磷酸盐缓冲液（PBS）和瓜尔胶溶液相比，GC@GAO/CAT水凝胶具有更低的平均摩擦系数（Coefficient of Friction, COF），且在测试初期形成稳定的润滑层，这归因于其剪切稀化行为和在亲水表面维持的水化层，有利于关节软骨的保护。 6. 力诱导增强的组织粘附：本研究提出并验证了一个创新机制：当水凝胶网络在机械应力下发生重排时，原本被交联网络固定的GAO/CAT酶会被重新暴露，从而恢复其催化活性，持续氧化网络中残留的半乳甘露聚糖底物，原位生成新的醛基。这些新醛基不仅能参与网络动态交联，更能与组织表面的氨基形成额外的席夫碱键，从而力诱导增强水凝胶与组织的界面粘附。SEM图像显示了水凝胶与软骨组织之间无缝、紧密的粘附界面。X射线光电子能谱（XPS）在界面处检测到了对应于亚胺氮（-C=N-）的新峰（~401.3 eV），为席夫碱键的形成提供了直接证据。搭接剪切实验进一步证实，随着瓜尔胶浓度（即潜在醛基含量）增加，水凝胶对牛软骨的搭接剪切应力也相应提高。
第三部分：水凝胶的催化活性与ROS/RNS清除能力研究
此部分重点验证了水凝胶所整合的多酶系统的生化调节功能。 1. 酶固定化与活性保留：通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）证实了荧光标记的GAO和CAT均匀分布并共定位于水凝胶网络中。酶动力学测试表明，固定化后的GAO和CAT保留了大部分催化活性。更重要的是，与游离酶相比，固定化显著增强了酶的长期稳定性（在37°C储存28天后，CAT仍保留81.78%的初始活性）。 2. 超氧化物歧化酶样活性：研究发现GAO作为一种单铜金属酶，其催化中心[Cu²⁺/(Cys-Tyr)•]在氧化底物和与氧分子循环的过程中，其电子传递机制与超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase， SOD）相似。通过WST-8显色法实验，证实了游离GAO和固定化GAO均能有效抑制超氧阴离子自由基（•O₂⁻）的产生，表现出SOD样活性。 3. 协同清除活性氧/氮物种：基于GAO/CAT的级联作用以及GAO的SOD样活性，该水凝胶被设计用于协同清除多种活性氧/氮物种（Reactive Oxygen/Nitrogen Species, ROS/RNS）。体外实验证明，水凝胶能有效清除•O₂⁻、H₂O₂、羟基自由基（•OH）、单线态氧（¹O₂）等ROS，以及过氧亚硝基阴离子（ONOO⁻）相关的RNS模型分子（ABTS•⁺， PTIO•）。 4. 在OA患者滑液中验证：为了验证其在病理微环境中的有效性，研究采集了OA患者的关节滑液。使用DCFH-DA和O71作为荧光探针分别检测ROS和RNS水平。结果显示，与未经处理的OA滑液相比，经GC@GAO/CAT水凝胶处理后，滑液中的ROS和RNS荧光信号显著降低，平均清除率分别达到60.2%和31.1%（100 mg·ml⁻¹浓度下），证明了其在复杂病理环境中调节氧化还原稳态的能力。
第四部分：体外细胞保护与抗炎作用评估
在应用于动物模型前，研究在细胞层面评估了水凝胶的生物相容性和生物活性。 1. 生物相容性：CCK-8实验表明，在10至100 mg·ml⁻¹的浓度范围内，水凝胶与RAW 264.7巨噬细胞共培养24/48小时后，细胞存活率均超过90%，显示出良好的细胞相容性。 2. 细胞内ROS/RNS抑制：在脂多糖（LPS）诱导的炎症细胞模型中，水凝胶处理能剂量依赖性地降低细胞内ROS和RNS的水平。 3. 抗炎与巨噬细胞表型调节：定量聚合酶链式反应（qPCR）分析显示，水凝胶处理可显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞中促炎因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平。免疫荧光染色进一步揭示，水凝胶处理能抑制巨噬细胞向促炎的M1表型（CD86标记物减少）极化，并促进其向抗炎的M2表型（CD206标记物增加）转化。
第五部分：体内OA治疗效果的评估
研究通过建立小鼠OA模型（内侧半月板失稳手术， DMM），验证了水凝胶的体内治疗效果。 1. 实验设计：OA造模4周后，对患侧关节进行一次性关节腔内注射GC@GAO/CAT水凝胶前体（10 μL），使其在关节内原位凝胶化。继续饲养4周后处死小鼠进行评估。 2. 组织学与评分：通过番红O/固绿（Safranin O/Fast Green）和H&E染色评估关节软骨、骨赘和滑膜的病理变化。与PBS治疗的OA组相比，水凝胶治疗组显示出更完整的软骨结构、更丰富的蛋白聚糖、更少的骨赘形成以及更轻微的滑膜炎。国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分、骨赘评分和滑膜炎评分均证实水凝胶治疗显著改善了OA的病理进程。 3. 胶原蛋白表达：免疫荧光染色显示，水凝胶治疗组的关节软骨中II型胶原（Col II）的表达水平显著恢复，与健康对照组无统计学差异。 4. 炎症与氧化应激标志物：免疫组织化学（IHC）染色和在大鼠OA模型上进行的酶联免疫吸附测定（ELISA）分析一致表明，水凝胶治疗显著降低了关节软骨和滑膜中促炎因子（IL-6， TNF-α）以及氧化应激生物标志物（8-OHdG）的表达水平。 5. 转录组学分析：对关节组织进行转录组测序分析。结果显示，与PBS组相比，水凝胶治疗组中有大量基因表达发生差异。KEGG通路富集分析表明，水凝胶下调了与“钙信号通路”、“细胞因子-细胞因子受体相互作用”和“HIF-1信号通路”相关的基因表达，这些通路与力诱导的炎症损伤、炎症反应和缺氧应激密切相关，从分子层面揭示了水凝胶通过机械-生化协同调控缓解OA的潜在机制。 6. 生物安全性评估：血液生化分析、全血细胞计数以及主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色均未发现水凝胶治疗引起系统性毒性或组织损伤，证明了其良好的体内生物安全性。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种基于GAO/CAT多酶级联催化的动态席夫碱交联策略，用于在生理条件下快速、原位构建全天然可注射多糖水凝胶。该策略无需外部引发剂、自由基或化学预修饰，具有高度的生物安全性。
该水凝胶集多种优良特性于一身：快速原位凝胶化（11秒， 37°C）、可调的力学性能、优异的剪切稀化与自修复能力、良好的润滑性，以及独特的力诱导增强组织粘附功能。更重要的是，其整合的GAO/CAT酶系统不仅驱动凝胶形成，还赋予了水凝胶固有的生化调节能力，包括SOD样活性和协同清除ROS/RNS的能力，从而能在病理微环境中调节氧化还原稳态并抑制炎症。
在OA小鼠模型中，一次性的关节腔内注射治疗通过机械保护（填充、润滑、耗能）与生化调节（清除ROS/RNS、抗炎）的协同作用，有效缓解了软骨退化、骨赘形成和滑膜炎，证实了其卓越的治疗效果。
研究的亮点与价值
其他有价值的内容
研究中对不同结构半乳甘露聚糖的凝胶化能力进行了系统筛选和机理解释，为后续基于类似原理选择其他多糖底物提供了理论依据。此外，转录组学分析不仅验证了治疗效果，还从系统生物学角度初步揭示了水凝胶发挥作用的信号通路网络，为深入理解其治疗机制奠定了基础。全面的生物安全性评估也为未来的临床前研究和潜在临床应用提供了重要的安全性数据支持。