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用于加速伤口愈合并具有保护作用的对香豆酸负载肝ECM支架与无细胞海洋海藻交联的机制研究

期刊:Advanced Functional MaterialsDOI:10.1002/adfm.202212325

类型a:这篇文档报告了一项原创研究。

主要作者和机构及发表信息
这项研究的主要作者包括Asuva Arin、Md Sohanur Rahaman、Ume Farwa以及通讯作者Byong-Taek Lee,他们都来自韩国Soonchunhyang大学医学院再生医学系和组织再生研究所。该研究于2023年发表在期刊《Advanced Functional Materials》上。

学术背景
本研究属于生物材料与再生医学领域,重点探讨如何通过天然来源的脱细胞基质(ECM)开发一种功能性伤口愈合材料。目前,理想的伤口敷料应具备无毒性、生物相容性、吸湿性、抗菌性等特性,但现有材料往往难以同时满足这些要求。此外,动物或植物来源的脱细胞ECM虽然富含生长因子和蛋白质,但由于机械强度不足,其应用受到限制。为了解决这一问题,研究团队提出利用脱细胞海藻(kelp)作为天然交联剂,并结合对香豆酸(p-coumaric acid, p-Cou)调节材料的理化性质,从而开发出一种具有优异伤口愈合能力的功能性支架材料。研究的目标是设计一种既能增强ECM机械性能又能提供生物活性的新型伤口愈合材料。

详细研究流程
1. 肝脏来源ECM的制备与表征
研究首先从猪肝中提取脱细胞ECM。通过使用去垢剂(如SDS)和酶处理(如DNA酶),去除细胞核、细胞器和其他免疫原性成分,同时保留ECM中的蛋白质和生长因子。随后,将脱细胞后的ECM冷冻干燥并研磨成粉末形式,用于后续实验。为了验证脱细胞效果,研究人员进行了组织学分析(H&E染色)、基因组材料(DNA)定量以及扫描电镜(SEM)观察。

  1. 海藻(kelp)的脱细胞处理与表征
    研究团队采集了褐藻(Saccharina japonica)并对其进行脱细胞处理。通过使用漂白剂和氢氧化钠溶液,成功去除了细胞内容物,得到脱细胞海藻。随后,对脱细胞海藻进行了化学成分分析(FT-IR光谱)、蛋白含量测定以及SEM观察,以确认其结构完整性和化学组成。

  2. ECM-kelp(EK)支架的制备与表征
    研究人员将肝脏来源的ECM与不同浓度的脱细胞海藻混合,通过冻融循环法制备了一系列EK支架(EK-5、EK-10、EK-15、EK-20)。每个样品均经过SEM观察以评估孔隙结构,并通过机械强度测试验证其物理性能。此外,研究还检测了支架中的ECM蛋白和生长因子含量。

  3. p-Cou的加载与优化
    由于高浓度海藻导致支架pH值升高,研究人员尝试通过延长洗涤时间降低pH值,但这会导致蛋白质和生长因子的损失。因此,他们选择将p-Cou作为酸性药物加载到EK-20支架中,以优化其理化性质。通过调整p-Cou的剂量,最终确定每支架4 mg为最佳剂量。

  4. 体外与体内实验

    • 体外实验:包括蛋白释放测定、生物降解性与溶胀性能测试、抗氧化能力测定、抗菌实验以及细胞毒性实验(MTT法和Almer Blue法)。
    • 体内实验:在大鼠背部制造全层皮肤缺损模型,分别用EK-20(pw)和EK-20@Cou进行治疗,并在第7天和第14天记录伤口愈合情况。通过组织学染色(H&E和Masson三色染色)和免疫组化分析,进一步评估伤口愈合的效果。
  5. 分子模拟(MS)与机制研究
    研究团队通过分子模拟预测了p-Cou与目标蛋白(如MMPs和NF-κB)的结合模式,并结合体内外实验数据揭示了EK-20@Cou促进伤口愈合的潜在机制。

主要结果
1. ECM与海藻的脱细胞效果
组织学分析和DNA定量表明,脱细胞过程有效去除了细胞成分,而FT-IR光谱显示脱细胞海藻中仍保留有纤维素、果胶和岩藻聚糖等关键成分。

  1. EK支架的物理与化学性质
    SEM结果显示,随着海藻浓度增加,支架孔隙逐渐减小且分布更加均匀。EK-20表现出最高的机械强度和蛋白含量。然而,高浓度海藻导致pH值显著升高,需通过加载p-Cou加以调节。

  2. 体外实验结果

    • 蛋白释放测定表明,EK-20@Cou在7天内释放了约30%的总蛋白。
    • 抗氧化能力测定显示,EK-20@Cou具有显著的自由基清除能力。
    • 抗菌实验表明,EK-20@Cou对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有强效抑制作用。
    • 细胞毒性实验显示,EK-20@Cou具有良好的生物相容性,可促进细胞增殖。
  3. 体内实验结果
    大鼠模型实验表明,EK-20@Cou在第7天实现了47%的伤口闭合率,在第14天达到了98.75%,远高于其他组别。组织学分析进一步证实,EK-20@Cou显著促进了新生表皮形成、胶原沉积和血管生成。

  4. 分子机制研究
    分子模拟和体内外实验共同揭示,p-Cou通过抑制MMPs活性和调节NF-κB信号通路,减少了炎症反应并加速了伤口愈合。

结论与意义
本研究表明,通过将脱细胞海藻作为交联剂并与p-Cou结合,可以成功制备一种具有优异伤口愈合能力的功能性支架材料。这种材料不仅具有良好的机械性能和生物相容性,还能通过抗氧化、抗菌和抗炎等多种途径促进伤口愈合。研究成果为开发下一代功能性生物材料提供了新思路,具有重要的科学价值和临床应用前景。

研究亮点
1. 首次提出利用脱细胞海藻作为天然交联剂增强ECM支架的机械性能。
2. 创新性地将p-Cou作为酸性药物加载到支架中,解决了高pH值的问题。
3. 揭示了p-Cou通过抑制MMPs和调节NF-κB信号通路促进伤口愈合的分子机制。
4. 提供了一种兼具高效性和安全性的新型伤口愈合材料。

其他有价值内容
研究团队还强调了分子模拟在功能材料设计中的指导作用,认为这种方法有助于未来开发更多基于天然来源的功能性材料。

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