本研究由来自中国科学技术大学（University of Science and Technology of China）生命科学与医学部、合肥微尺度物质科学国家研究中心、中国科学院深圳先进技术研究院以及中国科学院脑科学与智能技术卓越中心等多个机构的科研团队合作完成。通讯作者为Yuming Chai、Chen Shen和Quan Wen。该研究成果以题为“All-optical interrogation of brain-wide activity in freely swimming larval zebrafish”的论文形式，于2024年1月19日发表在开放获取期刊《iScience》上。
学术背景 该研究属于系统神经科学和光学神经技术领域。理解大脑中广泛分布的神经活动如何在时空维度上协同工作，进而产生动物行为，是神经科学的核心问题之一。近年来，全光学神经生理学（all-optical neurophysiology）技术——即同时利用光学方法进行神经活动记录（如钙成像）和操控（如光遗传学刺激）——为在活体动物中研究神经环路的功能连接及其与行为的因果关系开辟了新途径。然而，这项技术以往主要应用于头部固定（head-fixed）的动物模型，这限制了动物自然行为的表现，可能影响神经活动的真实状态。
斑马鱼幼鱼因其身体透明、大脑相对简单且易于进行基因操作，成为研究全脑神经动力学的理想模型。已有研究实现了在自由游动斑马鱼中进行全脑钙成像，但面临一个严峻挑战：动物自身的游动会产生巨大的运动伪影（motion artifacts），严重污染钙信号，使得从荧光强度变化中准确解读真实的神经活动变得极为困难。此外，在自由运动的动物中，对特定大脑区域进行实时光遗传学操控也面临巨大技术障碍，需要解决实时三维追踪、快速图像处理与配准、以及精确的光刺激定位等问题。
因此，本研究旨在开发一套全新的“全光学”系统，以实现在自由游动的斑马鱼幼鱼中，同步进行全脑范围的神经活动体积成像（volumetric imaging）和针对特定大脑区域的靶向光遗传学操控。其核心目标是：1）克服运动伪影，准确提取自由运动状态下的神经钙活动信号；2）建立实时、精准的光遗传学刺激方法，在动物自然行为状态下干预特定脑区；3）利用此集成系统，探究分布式神经环路活动与自然行为之间的因果关系。
详细工作流程 本研究是一个高度集成的技术开发与应用研究，其工作流程主要围绕一套复杂系统的构建、验证和应用展开，可分为以下几个核心步骤和模块：
1. 系统构建与集成： 研究团队构建了一套集三维追踪、双色荧光成像和实时光遗传学操控于一体的复合显微镜系统。该系统主要包括三个模块： * 三维追踪模块： 使用近红外（NIR）高速相机拍摄游动中的斑马鱼。与以往基于阈值分割的算法不同，本研究采用了一个简化的U-Net卷积神经网络来实时、鲁棒地识别鱼头和卵黄的位置。结合模型预测控制（Model Predictive Control, MPC）算法，系统能预测鱼的运动轨迹，并驱动高速电动载物台进行实时位置补偿，将鱼头稳定在显微镜的视场（field of view, FOV）内。同时，利用光场显微镜（Light-Field Microscope, LFM）原理，通过一个位于微透镜阵列后的自动对焦相机估算鱼的轴向（Z轴）位置，并用压电陶瓷平台进行补偿。 * 双色体积荧光成像模块： 使用扩展视野光场显微镜（xLFM）进行快速体积成像。关键创新在于引入了双色成像：使用488nm蓝色激光同时激发对钙离子敏感的绿色荧光蛋白指示剂（jGCaMP8s）和一种长斯托克斯位移的红色荧光蛋白（lssmCrimson）。后者作为活动无关的参考通道。通过分光镜，将绿色和红色荧光信号分别导入两个sCMOS相机进行同步记录。 * 实时光遗传学操控模块： 将一套光遗传学刺激系统整合到成像光路中。使用588nm黄色激光，通过一个二维振镜（galvo mirror）系统进行偏转，可将光斑精准投射到用户指定的大脑区域。刺激的靶点基于斑马鱼脑图谱（Zebrafish Brain Browser, ZBB）在线选择，并通过实时图像处理和坐标转换映射到实时拍摄的鱼脑图像上。
2. 运动伪影校正算法的开发与验证： 这是本研究的核心技术创新之一。为了解决游动导致的荧光信号波动问题，研究团队开发并应用了一种自适应滤波（Adaptive Filter, AF）算法。 * 原理： 运动引起的伪影主要来自两方面：照明光场的不均匀性，以及鱼体倾斜导致的荧光散射和衰减。AF算法利用红色参考通道（lssmCrimson）的信号历史，动态地预测绿色通道（jGCaMP8s）中由运动引起的基线变化。算法通过不断更新权重，最小化预测信号与实际绿色信号之间的残差。当神经活动发生时，残差会出现一个大的正峰值，从而被识别为钙活动信号。校正后的钙活动信号计算为 (G(n) - G_pred(n)) / G_pred(n)。 * 验证实验： * 首先，在全脑表达EGFP和lssmCrimson（无钙指示剂）的转基因斑马鱼上进行测试。由于EGFP信号不随神经活动变化，理想的校正结果应为一条平坦线。结果表明，AF算法在消除运动引起的EGFP信号波动方面，显著优于传统的比率计量法（ratiometric method）。 * 其次，在EGFP信号上叠加计算机生成的合成神经活动，测试AF算法从噪声中提取真实信号的能力。结果显示，AF算法能够准确地识别出这些合成信号。 * 最后，在表达jGCaMP8s和lssmCrimson的斑马鱼上，比较其在自由游动状态和琼脂糖固定状态下，对相同蓝光刺激（488nm成像激光本身作为刺激）的脑活动响应。通过相关性分析发现，经过AF算法校正后，两种状态下许多脑区的活动模式相似性显著提高，证明了该算法能有效还原自由运动状态下的真实神经活动。研究还设定了基于双通道信号相关性和红色通道信号变异系数（CV）的标准，来筛选出校正结果可靠的脑区用于后续分析。
3. 图像处理与配准流程： 为了从双色成像数据中提取信号，需要一套复杂的离线图像处理流程： * 图像配准（Registration）： 由于鱼在游动中大脑会发生形变，需要对每一帧三维体积图像进行对齐。本研究采用以活动无关的红色通道图像为主导的多步配准策略：1）根据行为相机记录的鱼头方向进行旋转和裁剪；2）使用CMTK工具包进行仿射变换（affine transformation），将每帧图像与一个模板（基于ZBB图谱生成）进行初步对齐；3）使用基于光流的非刚性配准算法（Maxwell‘s demons）进行精细对齐，以消除呼吸、心跳等引起的微小形变。为评估配准精度，研究者在稀疏表达EGFP的鱼上进行了测试，通过追踪单个神经元在不同帧间的位置偏移，证实了该流程的有效性。 * 兴趣区域（ROI）分割与信号提取： 对配准后的绿色通道图像，基于体素间的时间相关性进行 watershed 分割，定义出不同的脑区或神经元集群ROI。将相同的ROI映射到红色通道，提取双通道信号，并应用上述AF算法进行校正，最终得到每个ROI的神经钙活动信号。
4. 实时光遗传学系统的实现与测试： 为了实现在自由游动中对特定脑区的实时刺激，系统需要极快的图像处理速度。 * 优化： 通过对重建和配准算法进行优化（如图像降采样、减少重建迭代次数、使用深度学习模型计算仿射变换矩阵），将单帧图像处理时间缩短至80毫秒，快于成像采集速度（10 Hz）。 * 工作流程： 用户先在ZBB图谱上选择靶区 -> 系统实时处理红色通道图像，并将其与图谱对齐 -> 将图谱坐标转换为实时图像坐标 -> 生成控制振镜偏转的模拟电压信号 -> 将黄色激光精确投射到目标脑区。系统专门设计为在斑马鱼游动间歇期（bout intervals）进行刺激，因为鱼在快速游动期间（持续约300毫秒）的瞬时速度极高，难以实现精确靶向。 * 空间精度测试： 在表达jGCaMP8s、lssmCrimson和光敏感蛋白ChrimsonR的转基因鱼上，选择微小脑区进行刺激。通过观察刺激前后绿色荧光信号的变化，证实了系统能够准确激活目标区域，并能在不同鱼头朝向下持续靶向同一区域。
5. 系统应用：行为与全脑活动的因果关系研究 作为概念验证，研究团队利用该集成系统进行了一项实验，探究特定脑区激活对行为和全脑神经活动的影响。 * 研究对象与样本量： 使用转基因斑马鱼（elavl3:h2b-jGCaMP8s - elavl3:h2b-lssmCrimson × elavl3:ChrimsonR-tdTomato，7 dpf），实验组n=6条鱼。对照组为不表达ChrimsonR的鱼（elavl3:h2b-jGCaMP8s - elavl3:h2b-lssmCrimson），n=5条鱼。 * 实验与数据分析： * 行为学： 对包括中脑内侧纵束核（nMLF）在内的被盖区（tegmentum）进行单侧（1.5秒）光遗传学刺激。结果发现，刺激能可靠地（在大多数情况下）在2秒内诱发鱼向刺激同侧（ipsilateral）的转向行为。而对照组鱼在受到相同光刺激时，没有表现出方向偏好性，转向幅度也小得多。 * 全脑活动分析： 在光遗传学刺激nMLF期间，记录全脑钙活动。分析显示，刺激后神经活动出现在多个脑区，包括被盖、视顶盖、半规管隆起和小脑。通过计算全脑活动模式（一个高维向量）在不同试次间的皮尔逊相关系数，发现刺激同侧脑区时诱发的全脑活动模式彼此更相似，而异侧刺激间的相似性较低。 * 神经活动解码行为： 利用AF校正后的50个广泛分布的脑区活动数据，采用线性判别分析（Linear Discriminant Analysis, LDA），能够以93.6%的准确率解码斑马鱼自发转向的方向（左或右）。这证明了从自由游动斑马鱼中提取的群体神经活动信息具有高度的行为相关性。
主要结果 1. 高性能三维追踪系统： 新开发的基于U-Net和MPC的追踪系统，在复杂背景下表现出高鲁棒性。在所有时间点中，92.6%的图像帧的追踪误差（鱼头中心与显微镜视场中心的距离）小于100微米（足以覆盖全脑）；即使在鱼运动期间，也有58.69%的帧满足此条件，显著优于旧系统（25.4%）。Z轴自动对焦模块能将93.29%的图像保持在景深范围内。 2. 有效的双色图像配准与运动伪影校正： 开发的多步图像配准流程能有效对齐自由游动鱼脑的三维图像，神经元质心的均方根位移远小于分割ROI的大小。AF算法在消除运动伪影方面优于传统比率法，并能从受污染信号中提取出合成或真实的神经活动信号。蓝光刺激实验表明，经AF校正后，自由游动与固定状态下许多脑区的活动模式相关性提高，验证了校正的有效性。 3. 实时光遗传学操控的实现： 系统实现了在自由游动斑马鱼中对用户定义脑区的实时、精确光刺激。图像处理延迟低于成像帧周期，刺激光斑的X和Y方向半高全宽（FWHM）分别为7.8微米和6.7微米，证明了其空间特异性。系统能在鱼的不同朝向下稳定靶向同一脑区。 4. 因果行为操控与全脑活动观测： 应用该系统，首次在自由游动斑马鱼中实现了全光学的因果探究：单侧光遗传学刺激中脑nMLF区域，可可靠地诱发同侧转向行为。同时，全脑钙成像揭示了该局部操控如何引发分布式脑区的活动变化，并且刺激同侧诱发的全脑活动模式具有相似性。此外，从校正后的全脑活动中，可以高精度解码出自发转向的方向。
结论与意义 本研究成功开发并验证了一套用于自由游动斑马鱼幼鱼的全光学脑功能 interrogation 系统。该系统整合了鲁棒的三维追踪、基于双色成像和自适应滤波的神经活动精确提取、以及针对特定脑区的实时光遗传学操控三大功能。这项工作的主要价值和意义在于： * 科学价值： 它打破了以往全光学研究多局限于头部固定动物的技术壁垒，为在完全自然行为状态下研究神经环路的动态与行为之间的因果关系提供了强有力的工具。研究者可以主动操控特定脑区，并同步观察由此引发的全脑尺度神经活动变化和自然行为输出，这对于理解大脑如何编码和产生行为至关重要。 * 技术价值： 本研究提出并验证了自适应滤波算法在解决自由运动小动物钙成像运动伪影问题上的有效性，为相关领域提供了新的解决方案。同时，将高速追踪、快速体积成像、实时图像处理与配准、以及闭环光刺激整合到一个平台，代表了光学神经技术领域的一项重大进展。 * 应用前景： 该方法可与近期发展的其他体积成像技术结合，显著推进对斑马鱼及其他模式生物各种自然行为背后神经机制的研究。通过结合特定的基因表达系统（如Gal4/UAS），未来可以实现对特定细胞类型进行操控和记录，从而在细胞类型特异性水平上解析神经环路功能。
研究亮点 1. 方法学的集成与创新： 本研究最突出的亮点是成功地将多个前沿技术模块（高速追踪、光场显微镜、双色成像、自适应滤波算法、实时图像处理、闭环光遗传学）无缝集成到一个工作系统中，解决了在自由运动小动物中实现“读取”与“写入”脑活动的重大技术挑战。 2. 自适应滤波算法校正运动伪影： 创新性地将AF算法应用于钙信号校正，通过利用活动无关的红色参考通道信号来动态估计并去除运动引起的绿色通道信号变化，比传统比率法更有效地处理了由组织散射和衰减引起的复杂伪影。 3. 在自由行为中实现靶向光遗传学： 首次在自由游动的斑马鱼中实现了基于实时图像反馈的、对用户自定义脑区的精确光遗传学刺激，将空间精确的光遗传学操控从头部固定动物扩展到了自由移动动物。 4. 全光学因果验证： 利用该集成系统，演示了一个完整的“刺激-全脑活动记录-行为观测”因果研究闭环，直接证明了刺激中脑特定区域可诱发特定转向行为，并揭示了该局部操控引发的全脑活动模式变化。 5. 高精度行为解码： 证明了从经过运动校正的全脑钙活动中，可以高精度地解码出动物的自发行为方向，凸显了该方法提取的神经信号具有高质量的行为相关性。
其他有价值的内容 * 研究局限性： 作者在文中坦承了当前系统的局限性，例如光遗传学模块缺乏Z轴分辨率（即无法精确控制刺激的深度），以及AF算法在双通道信号相关性或信噪比较低的脑区可能不够准确。他们提出了未来的改进方向，如使用更透明的鱼系（如Casper）、更亮的荧光蛋白、以及开发更精细的双通道信号统计模型。 * 与现有技术的比较： 文章将本系统与已有的斑马鱼全脑成像技术、其他运动校正方法（如直接比率法）、以及两类光遗传学实验（头部固定下的空间模式刺激 vs. 自由游动下的全场刺激）进行了对比，阐明了本工作的优势与独特性。 * 对未来发展的展望： 作者展望了将该技术与双光子光遗传学、全息技术结合以提高操控精度，或利用分子生物学工具（如核定位序列、特定启动子）进一步提高成像分辨率和操控特异性的可能性。