作者与发表信息
本研究由 Shuo Yan、Wenjing Xu、Yuping Fan、Penghui Liu、Wei Wang、Bo Dong 和 Xiuxia Yang 等人完成，通讯作者为 Xiuxia Yang（xxyang@ouc.edu.cn）。研究团队来自中国海洋大学海洋生命学院方宗熙海洋进化发育研究中心、海洋遗传与育种教育部重点实验室，以及青岛海洋科学与技术试点国家实验室。该研究作为开放获取的研究论文（Research Article）发表于 *The FASEB Journal*，2025 年第 39 卷，文章编号 e70870，DOI 为 10.1096/fj.202501104r。
研究背景
再生现象广泛存在于动物界，从无脊椎动物到脊椎动物均有分布，但不同物种的再生能力差异显著。再生在术语上分为两种主要类型：新建再生（epimorphosis）和变形再生（morphallaxis）。新建再生以细胞增殖和芽基（blastema）形成为特征，例如蝾螈的肢体再生；而变形再生则主要依赖已有细胞的重塑，如Hydra的再生。芽基通常由来源多样的异质性细胞亚群组成，对所有再生器官的形成至关重要。构成芽基的增殖细胞可分为成体多能干细胞、组织限制性祖细胞以及由终末分化细胞去分化产生的祖细胞等多种类型。
整合素（integrin）是细胞黏附分子的主要家族，介导细胞与细胞外基质（ECM）的黏附并传递机械与化学信号。整合素α6（integrin alpha 6, ia6）亚基通常作为整合素α6β1或α6β4的组成部分发挥作用，其表达对多种细胞类型的迁移能力具有调节作用。在群体海鞘 Botrylloides diegensis 中，ia6阳性造血细胞对再生至关重要——早期再生阶段大部分增殖细胞均可被ia6标记，且移植ia6阳性血细胞足以完成整个再生过程。
海鞘（ascidian）是脊椎动物现存亲缘关系最近的类群，因其相对简单的身体构型和卓越的再生能力而被广泛用作再生研究模型。成体 Ciona 具有两个远端管状结构：口吸管（oral siphon, OS）和心房吸管。已有研究表明 Ciona 口吸管再生涉及芽基形成，且Notch信号通路通过维持芽基的增殖活性调控再生。然而，构成芽基的确切细胞类型以及指导细胞驻留于芽基的分子机制仍不明确。本研究旨在系统解析 Ciona robusta 口吸管再生过程中芽基形成的形态学阶段，鉴定构成芽基的关键细胞类型，并揭示其调控的分子机制。
研究流程与方法
本研究主要包含四大实验模块：再生形态学分期与芽基鉴定、ia6阳性细胞的功能验证、转录组测序分析、以及Wnt信号通路的功能验证。
（一）再生形态学分期与芽基鉴定
研究选用体长5–6厘米的成体 *C. robusta*，经MS222麻醉后切除口吸管前半部分，术后转移至持续充气的循环海水中培养观察。再生过程根据形态学和细胞学特征划分为四个阶段：第1阶段（截肢后24–48小时，hpa）在再生部位出现明显的细胞聚集；第2阶段（约72 hpa）出现细胞分化，可见多排横向肌动蛋白纤维束的新生；第3阶段（约120 hpa）细胞伸长，原有纵向肌动蛋白纤维从截肢部位延伸；第4阶段（约144 hpa）完成形态恢复，形成6–8个具有特征性弯曲的口吸管瓣叶（lobes），以及位于相邻瓣叶间壁龛中的等数量口吸管色素器官（oral siphon pigment organ, OPO）。为确认芽基在第1阶段是否出现，研究采用BrdU脉冲追踪法检测聚集细胞的增殖能力。截肢后动物在含BrdU的海水中浸泡，随后进行组织固定与免疫荧光分析。结果显示，未截肢对照组中BrdU阳性细胞稀疏分布于管壁和OPO，而截肢后增殖细胞数量逐渐增加，尤其在吸管残端远端的再生部位显著聚集，证明芽基的形成。
（二）ia6阳性细胞的功能验证
为鉴定芽基的细胞组成，研究选取ia6（胚胎干细胞、神经干细胞和造血干细胞中共同表达的基因）和piwi（传统干细胞标志物）进行免疫组化检测。截肢后不同再生阶段收集吸管残端进行免疫荧光分析。结果显示，0 hpa时ia6阳性细胞在OS管壁内呈基线分布；24 hpa时数量显著增加并聚集于芽基部位；随后数量下降，但在后期再次增加并聚集于OPO部位。相比之下，piwi阳性细胞虽然分布于整个口吸管壁，但数量较低且未在芽基处聚集，仅在120 hpa时于OPO部位聚集。为验证ia6阳性细胞的功能，研究采用RNA干扰（RNAi）技术，将靶向ia6基因的siRNA-508与阴性对照siRNA分别溶于海水中，截肢后立即浸泡动物，每48小时更换一次含siRNA的海水。在72和120 hpa评估再生进程。免疫染色显示siRNA处理组ia6阳性细胞较对照组显著减少，RT-qPCR证实ia6表达被成功抑制。相应地，这些动物的吸管再生受损，表现为边缘模式和OPO保真度的破坏。
（三）转录组测序分析
为探索调控芽基形成的分子机制，研究对0、48和120 hpa的吸管残端组织进行RNA-seq分析。各文库分别获得40,519,606、53,234,666和46,024,366条reads，比对率分别为69.76%、88.98%和82.08%。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为倍数变化≥2且校正p值<0.05。48 hpa与0 hpa相比有2284个基因上调、1447个基因下调；120 hpa与48 hpa相比有1744个基因上调、2184个基因下调。为识别与芽基形成相关的关键基因，研究整合了48 hpa文库中上调的基因（与0 hpa和120 hpa相比），获得319个候选基因。KEGG通路分析显示MAPK信号通路和细胞连接通路显著富集，同时Wnt信号通路也被富集。基于Wnt信号在干细胞调控中的已知作用，研究选择了Wnt家族基因（wnt5a、wnt6、wnt7b、wnt9a和wnt10a）进行RT-qPCR验证。溶解曲线分析显示每个反应均有单一锐峰，表明特异性扩增。
（四）Wnt信号通路的功能验证
研究使用cardamonin（Wnt通路抑制剂）进行功能验证。抑制剂溶于DMSO后，在截肢后立即注射入鳃囊横血管，每只动物注射1微升。测试浓度为2.5 μM、5 μM和10 μM，对照组注射等体积DMSO，每组10只动物。通过Imaris软件的斑点检测功能定量芽基部位的ia6阳性细胞比率（每立方毫米内ia6阳性细胞数）。结果显示，2.5 μM处理组效果甚微，但随着抑制剂浓度增加，芽基部位的ia6阳性细胞数量显著减少，表明Wnt抑制剂以剂量依赖性方式影响芽基形成。
主要结果与逻辑关系
本研究的实验结果形成了层层递进的逻辑链条。首先，形态学观察和BrdU标记实验确立了口吸管再生中芽基形成的关键时间窗口（24–48 hpa），为后续细胞类型鉴定提供了时间框架。芽基的确认直接引出了“什么细胞构成芽基”的问题，导向ia6和piwi的免疫组化分析。结果明确显示ia6阳性细胞而非piwi阳性细胞在芽基部位聚集，这一发现将ia6阳性细胞定位为芽基的主要贡献者，并推动了后续的功能验证实验。RNAi实验证实了ia6表达的降低会导致再生受损，建立了ia6阳性细胞与再生之间的因果关系。在此基础上，研究进一步探索“什么分子机制调控ia6阳性细胞向芽基聚集”，通过RNA-seq分析发现Wnt信号通路在芽基形成期被激活，RT-qPCR验证了多个Wnt配体基因的表达上调。最后，药理学抑制实验证实Wnt通路的阻断会导致ia6阳性细胞在芽基部位的数量减少，从而将Wnt信号通路与ia6阳性细胞的募集联系起来，完成了从现象观察到机制解析的完整研究链路。
研究结论与意义
本研究建立了基于细胞过程的四阶段分类体系来描述 Ciona robusta 口吸管再生中OPO替换过程，包括芽基形成、横向肌动蛋白纤维分化、纵向纤维延伸和OPO重建。核心发现是ia6阳性细胞——而非piwi阳性细胞——是芽基不可或缺的组成部分，并在后续贡献于再生组织。此外，研究发现规范Wnt（canonical Wnt）信号通路通过影响ia6阳性细胞在损伤部位的聚集来调控芽基形成。该研究的科学价值在于揭示了跨越后口动物（deuterostome）再生机制的进化保守性，为理解脊椎动物感官器官再生失败的挑战提供了新视角。从应用角度看，由于基因和分子调控在动物界高度保守，这些机制可能为再生能力有限物种（如哺乳动物）的再生工程化改造提供参考，对再生医学领域具有潜在价值。
研究亮点
本研究的亮点体现在三个方面：其一，首次在 Ciona robusta 中系统鉴定出ia6阳性细胞作为再生芽基的关键细胞类型，并将其与piwi阳性细胞的功能区分开来；其二，揭示了Wnt信号通路对ia6阳性细胞向芽基部位聚集的调控作用，提出了“Wnt信号—ia6阳性细胞募集—芽基形成—再生”的新型调控机制；其三，研究方法上整合了形态学分期、BrdU脉冲追踪、免疫荧光、RNAi干扰、RNA-seq和药理学抑制等多层次手段，尤其是利用Imaris软件进行三维定量分析，为海鞘再生研究提供了方法学参考。
其他有价值的内容
研究还观察到横向肌动蛋白纤维（推测为环肌纤维）是新生形成的，而纵向肌动蛋白纤维（推测为纵肌纤维）是从损伤部位延伸而来，这种分化差异可能与不同肌肉纤维类型的功能角色有关。此外，研究提出ia6阳性细胞可能通过循环系统迁移至损伤部位，这与先前报道的海鞘循环系统中存在可迁移干细胞的观点一致。关于ia6阳性细胞的来源，研究推测存在增殖和迁移两种可能途径，该问题仍有待进一步探究。