Academic Report

研究作者及出版信息

这项研究的主要作者包括 Liming Luo、Jocelyn Duen-Ya Jea、Yan Wang、Pei-Wen Chao 和 Laising Yen，他们隶属于美国德克萨斯州休斯敦市贝勒医学院 (Baylor College of Medicine) 的病理与免疫学系、分子与细胞生物学系以及 Dan L. Duncan 癌症中心。本研究发表于 Nature Biotechnology，其在线发表时间为 2023 年，DOI 为 10.1038/s41587-023-01989-0。

研究背景和意义

该研究属于基因表达调控领域，其内容聚焦于安全、高效的基因治疗以及哺乳动物基因功能的研究。控制哺乳动物细胞中基因表达不仅是开发安全有效的基因治疗方法的关键，也是理解基因功能的核心。然而，目前的基因调控系统面临一些主要局限性，例如可能引发有害的免疫反应或调控效率低下。

现有的基因调控方法，例如 Tet-On 系统，长期以来成为研究工具，但由于其涉及外源蛋白调控器（如转录激活因子），容易引发宿主免疫反应，因此至今尚未在临床应用中获批使用。同时，传统 RNA 基因调控系统，如核酶或核糖开关，往往存在如下问题：使用高毒性配体、动态范围不足、高背景表达泄漏以及需要高浓度配体才能有效诱导。针对这些不足，新研究提出了一种名为 “PA Regulator” 的 RNA 基因调控系统，旨在通过非免疫原性的设计克服这些挑战。

研究的总体目标是开发一种安全、有效、动态范围广、可逆的基因调控系统，兼具临床和实验应用的前景。

研究流程与方法

本研究以开发和优化 PA Regulator 为核心，整个工作流程分为以下几个主要步骤：

1. PA Regulator 基础设计
   研究团队首先通过将合成 polyA 信号（Polyadenylation Signal，简称 PAS）嵌入到目的基因的 5′ UTR 中，形成了一个 RNA 调控开关。为了调控 PAS 对 mRNA 的切割效率，设计了一个 RNA 适配体结构，作为 PAS 的“夹钳”。此适配体可以通过与四环素（Tetracycline，简称 TC）结合改变其结构稳定性，从而影响 PAS 的切割效率。研究采用了已知的 CB32 适配体作为基础模板，并进一步优化其链接结构。

2. PAS 功能优化与适配体结合位点的筛选
   研究通过实验优化了 PAS 和 RNA 适配体在 5′ UTR 上的结合位点。通过系统性地改变适配体下游结构（如 P1 和 P2 茎环的长度、PAS 与富含 GU 区域之间的距离等），研究确定了最佳 PAS 位置和周边序列。在实验中，研究团队使用含荧光酶报告基因的质粒，关键数据如 PAS 切割效率和诱导倍数通过荧光酶活性水平进行定量。

3. 改进 PA Regulator 的 RNA 结构
   研究过程中尝试了多种 RNA 茎环结构，最终采用了“Y 字形”三适配体交联结构。通过将三个适配体聚合至一个关键性三通道连接点，显著增强了 PAS 的调控能力。例如，将新的突变（如 A42G）引入适配体进一步优化了 TC 引导的 PAS 阻断效果。最终实验结果显示，这种优化结构可在安全浓度（例如 1 μg/mL TC）范围内实现 60 倍以上的基因诱导效应。

4. 双重调控机制的开发：PAS 夹钳 + 可诱导选择性剪切机制
   为进一步提高调控效能和动态范围，研究团队开发了一个全新的“可诱导选择性剪切”机制。通过在 PAS 上游引入一个 G-四链体（G-quadruplex）结构，并结合适配体对局部 RNA 结构稳定性的调控，研究实现了配体（TC）依赖的剪接切换机制。该机制能够在核内移除 PAS，从而完全解除 PAS 对 mRNA 表达的抑制。

5. 优化与验证
   研究团队进一步对系统的多个元件进行了优化，包括减少背景泄漏表达、缩短内含子长度以及调整不同适配体的贡献权重。最终版本的 PA Regulator 系统（如 Y387 和 Y395 构建体）在低 TC 浓度下实现了前所未有的 900 倍诱导效率，同时保持极低的背景泄漏表达（< 0.1%）。

主要结果与数据

1. 调控效率与动态范围
   最终优化的 Y387 和 Y395 构建体在 1 µg/mL TC 时，分别实现 800 倍和 900 倍的诱导效应，且 EC50（半数最大效应浓度）低于 FDA 批准的临床剂量范围（0.5 µg/mL TC）。

2. 稳定性与可逆性
   PA Regulator 在小鼠模型（通过 AAV 病毒载体转染入肌肉组织）中成功实现可逆、稳定的基因调控。不同 TC 剂量的单次注射诱导了高达 300 倍的荧光素酶表达，重复注射三个月后仍可稳定调控。

3. 控制内源基因表达
   使用 CRISPR/Cas9 技术将 PA Regulator 插入人类 PROM1（编码 CD133 蛋白）基因位点后，成功在 293T 细胞中诱导表达内源性 CD133 蛋白，高达 1200 倍的诱导倍数，EC50 仅为 0.4 µg/mL TC。

研究结论及意义

PA Regulator 系统通过结合 PAS 切割调控和可诱导剪切机制，提供了一种全新的基因调控手段。其科学价值体现在以下几个方面：

1. 安全性
   PA Regulator 完全避免了外源蛋白调控因子，有效降低了免疫原性，适用于基因治疗与基础研究。

2. 高效性
   研究首次实现了 RNA 基因调控系统超过 900 倍的诱导效率，同时保持极低背景泄漏表达。

3. 广泛的应用前景
   PA Regulator 在多种哺乳动物细胞系、稳定基因编辑及活体动物模型中表现出卓越性能，不依赖特殊启动子，可适配任意 Pol II 启动子。

4. 高度的可逆性与动态调控能力
   实现了与药物剂量高度相关的敏感性调控，为更多个性化治疗开发提供了可能。

亮点与创新

• 首创性利用 5′ UTR 中 PAS 的调控机制。
• 开发了含三适配体的“Y 字形”结构，显著增强了分子开关的调控效率。
• 提出并验证了一种全新的 G-quadruplex 介导的可诱导选择性剪切机制。
• 系统设计紧凑，可直接集成于单质粒或病毒载体。

对未来的潜在挑战与展望

尽管 PA Regulator 展现了极大的潜力，但目前的系统仅能使用 TC 作为诱导剂，可能限制其在某些组织的适用性。因此，未来需要开发针对更多配体的适配体模块，以扩展其适应范围。此外，研究为 RNA 调控领域提供了新框架，预期将引发广泛的探索与优化工作。