本文属于类型a，是一篇关于羧酸还原酶（carboxylic acid reductase, CAR）理性工程改造以提高催化效率与底物耐受性并实现绿色香兰素生物合成的原创研究论文。该研究由华东理工大学（East China University of Science and Technology）生物反应器工程国家重点实验室的Wei-Bing Liu（刘卫兵）与Bang-Ce Ye（叶邦策）团队完成，第一作者为Hanyu Zhu（朱涵宇），其他作者包括Longzheng Huang、Ximeng Liu与Yiyang Zhang。论文发表于Journal of Agricultural and Food Chemistry，2026年第74卷第33184–33194页。
香兰素（vanillin）是一种高价值天然芳香化合物，广泛用于食品、香精香料与医药领域。目前香兰素商业化生产主要依赖植物提取、化学合成和微生物生物转化三种方式，其中微生物合成的香兰素因符合国际食品添加剂法规可被界定为“天然香兰素”，兼具环境友好性和食品级安全性，成为最具潜力的替代路线。在微生物合成香兰素的路径中，羧酸还原酶催化香草酸（vanillic acid, VA）还原为香兰素是核心限速步骤。然而野生型CAR普遍存在催化活性低、热稳定性差以及高底物浓度下严重底物抑制等缺陷，限制其工业化应用。因此，本研究旨在通过酶工程策略改造CAR，提高其对香草酸的催化效率与底物耐受性，并建立从葡萄糖到香兰素的高效生物合成体系。
研究首先从10种细菌CAR同源酶中筛选高效催化香草酸还原的候选酶。这些CAR均属于第一类CAR亚家族，其天然底物偏好芳香族和空间位阻较大的羧酸。通过在大肠杆菌K-12 MG1655 RARE菌株中异源表达并评价全细胞催化性能，发现来源于Mycobacterium abscessus的ma7CAR、Mycobacterium marinum的mmCAR、Mycobacterium avium的mavCAR和Segniliparus rugosus的srCAR具有较高的香草酸转化能力，其中ma7CAR在5 g·L−1 VA条件下几乎实现完全转化。为消除香兰素对生长细胞的细胞毒性干扰，后续实验采用静息细胞催化模式。
第二步，研究利用结构域重组策略构建嵌合CAR。CAR由N端腺苷化（adenylation, A）结构域、中间磷酸泛酰巯基乙胺附着（phosphopantetheine attachment, P）结构域和C端还原酶（reductase, R）结构域组成。A结构域主导底物识别与结合，是决定催化效率和底物适应性的关键区域。研究从上述4个高活性亲本CAR出发，通过交换A结构域与PR双结构域，构建了12个杂交CAR突变体。结构域边界通过多序列比对和已有结构功能研究确定。全细胞催化评价显示所有嵌合酶均较亲本有所提高，其中mm(A)-mav(PR)CAR在高底物条件下表现最佳：在10 g·L−1 VA初始浓度下6小时内生成4.91 g·L−1香兰素，其摩尔转化率分别是野生型mmCAR的2.02倍和mavCAR的1.76倍。
第三步，针对最优嵌合酶mm(A)-mav(PR)CAR进行结构指导的定向进化。由于该嵌合酶缺乏晶体结构，研究利用AlphaFold2进行同源建模，并将底物VA对接至活性中心。通过分子动力学模拟分析底物结合口袋动态特征，在距底物结合腔5 Å范围内选择44个氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变。高通量筛选基于香兰素在340 nm处的特征紫外吸收。结果显示I303、T390、Y415、D922、P995和D996六个位点对催化活性具有显著调控作用。对这些位点进行定点饱和突变后，获得单点突变体T390A（命名为M1），其摩尔转化率达64.53%，为野生型嵌合酶的1.19倍。
第四步，通过底物通道重塑进一步缓解底物抑制并提高催化性能。研究首先利用AlphaFold2预测M1的三维结构，并用CAVERweb软件分析潜在底物传输通道。共识别出20条候选通道，其中4条直接起源于催化活性中心并与VA天然结合取向匹配。分子动力学模拟表明通道1具有最佳结构稳定性和底物可及性。通道1的瓶颈区域位于22–22.5 Å，由R277、W279、T289、M299、Q302、E336和T338等残基构成。研究将该瓶颈区域残基替换为小位阻氨基酸，构建63个单点突变体，筛选获得6个阳性突变体。进一步迭代组合构建5个双突变体和3个三突变体，最终获得四重突变体Q302C/R277L/T338N/T390A（命名为M4）。在高底物条件下，M4的VA摩尔转化率达92.21%，是M1的1.43倍。
动力学分析表明，所有工程化突变体的kcat和kcat/Km值均高于亲本M0，其中M4的kcat/Km达到55.6 s−1·mM−1，是M0的1.6倍。分子对接和结构模拟揭示，T390A突变优化了活性口袋微环境，降低腺苷化步骤活化能；Q302C/R277L/T338N组合突变缩短了底物通道有效长度（从41.2 Å降至24.6 Å）并扩大瓶颈半径至1.1 Å，从而缓解底物抑制。此外，M4与VA之间形成了两个额外氢键，增强了酶-底物复合物稳定性，优化了底物结合构象。
在规模化生物催化制备中，M4全细胞催化剂在50 mL反应体系中通过两阶段分批补料策略实现了95%的VA到香兰素转化效率。进一步结合前期构建的恶臭假单胞菌KT2440 XCS17菌株从葡萄糖从头合成香草酸平台，建立了“两锅两步”级联生物催化体系，最终从葡萄糖实现90%的香兰素转化率。与此前报道的CAR介导香兰素合成体系相比，M4系统在高底物浓度下的底物耐受性和转化效率具有明显优势。
该研究的科学价值在于系统整合了结构域重组、结构指导的定向进化和底物通道重塑等多层次酶工程策略，成功突破了CAR在芳香酸还原中的催化活性和底物抑制瓶颈，阐明了隧道扩张与氢键重塑协同稳定酶-底物结合的分子机制。其应用价值在于提供了一种高效、可持续的天然食品级香兰素绿色生物合成路线，为高价值芳香醛和酚类化合物的生物制造提供了通用技术参考。研究亮点包括：首次通过A/PR结构域交换构建出性能显著提升的嵌合CAR；利用计算模拟指导的丙氨酸扫描与定点饱和突变精准重塑活性口袋；通过底物通道瓶颈残基的小位阻替换策略有效缓解高浓度底物抑制；最终实现从廉价可再生碳源葡萄糖出发的香兰素高效从头合成，为制备级绿色生物合成奠定了基础。