类型a：原创研究学术报告
一、研究概况与作者信息
本项研究由来自湖北医药学院附属太和医院心内科的毛山（Shan Mao）、罗向红（Xianghong Luo）和周明（Ming Zhou），江门市中心医院（中山大学附属江门医院）麻醉科的田术宁（Shuning Tian），以及贵州医科大学第二附属医院心血管内科的曹政（Zheng Cao）和纪丽（Ji Li）共同完成。通讯作者为纪丽。该研究成果于2021年6月11日在线发表于开源期刊《Bioengineered》第12卷第1期，页码为2676至2687。论文标题为《过表达PLK1通过诱导线粒体自噬（mitophagy）并调控p-AMPK/FUNDC1轴减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤》。
二、学术背景与研究目的
心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）是全球心血管疾病患者高致残率和高死亡率的主要原因。心肌梗死后的修复机制极为复杂，目前的临床治疗手段主要集中于缓解症状，但无法解决心肌细胞（cardiomyocytes）丢失这一根本问题。研究表明，心肌缺血导致的心肌细胞死亡是心肌梗死后心室重构、心功能不全和心律失常的关键原因，而线粒体功能障碍是导致心肌细胞死亡的核心环节。受损的线粒体会产生超过正常线粒体十倍以上的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），大量的活性氧会直接损伤线粒体蛋白和DNA，加剧线粒体功能障碍，形成恶性循环。已有研究证实，适度的线粒体自噬可以保护机体免受缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion, I/R）损伤。因此，调控心肌细胞的线粒体自噬被视为治疗心肌梗死的一种潜在策略。
Polo样激酶1（Polo-like Kinase 1, PLK1）是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶PLK家族中最具特色的成员，它在调节细胞周期进程和协调细胞分裂中发挥关键作用，并能通过调节有丝分裂抑制肿瘤细胞的凋亡。有研究发现，PLK1参与神经元自噬过程，且下调其表达会间接抑制乳腺癌细胞的线粒体自噬。此外，PLK1在心肌细胞增殖和心脏再生中也扮演关键角色。基于此，研究者推测PLK1可能参与心肌保护和线粒体自噬，但其对缺血性心肌损伤的具体功效和机制尚不明确。
在机制探索方面，已有研究发现PLK1通过调控AMPK（AMP-activated protein kinase）的活性促进有丝分裂。而激活AMPK可通过上调OPA1表达增加线粒体自噬和融合，从而减轻心肌缺血损伤。更重要的是，AMPK可以调节多种细胞中线粒体受体FUNDC1（FUN14 domain-containing 1）的表达。FUNDC1是一种在心脏疾病中起保护作用的新型线粒体受体，激活FUNDC1能增加缺血再灌注损伤后心肌细胞的线粒体活性，抑制线粒体凋亡，减少氧化应激，并维持线粒体膜电位和ATP的产生。FUNDC1还能通过诱导线粒体自噬来保护线粒体，而抑制FUNDC1介导的线粒体自噬会加重心脏缺血再灌注损伤。因此，本研究旨在阐明PLK1是否能通过调控AMPK/FUNDC1信号通路诱导线粒体自噬，从而保护心肌免受缺血再灌注损伤，为临床治疗心肌缺血再灌注提供新策略。
三、详细研究流程
本研究综合运用了动物模型和细胞模型，通过多个实验步骤系统性地探究了PLK1的作用及其机制。
在动物实验部分： 首先，为观察缺血再灌注对PLK1表达的影响，研究者将12只SD大鼠（Sprague-Dawley rats）分为假手术组（Sham）和缺血再灌注组（IR），每组6只，通过结扎冠状动脉的方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型。处死大鼠后收集心脏组织，利用免疫印迹法（Western Blotting）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌组织中PLK1的信使核糖核酸（mRNA）和蛋白质表达水平。 其次，为探究PLK1过表达对心肌损伤的影响，研究者将另外24只缺血再灌注模型大鼠分为四组：假手术+腺病毒空载体组（Sham+Ad-NC）、假手术+PLK1过表达腺病毒组（Sham+Ad-PLK1）、缺血再灌注+腺病毒空载体组（IR+Ad-NC）和缺血再灌注+PLK1过表达腺病毒组（IR+Ad-PLK1），每组6只。通过注射腺病毒过表达PLK1后，收集大鼠心脏和血清。采用1%氯化三苯基四氮唑（TTC）和2%伊文思蓝（Evans Blue）双重染色法检测心肌梗死面积，并使用ImageJ软件进行定量分析。同时，采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测血清中乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）水平。此外，利用TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色法检测心肌组织的细胞凋亡情况，并用免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）的表达。为探究机制，研究者还通过免疫印迹法检测了心肌组织中线粒体自噬相关蛋白LC3 II/LC3 I和Beclin1的表达。
在细胞实验部分： 研究者采用大鼠心肌细胞系H9c2进行体外实验。为模拟体内缺血再灌注的生理环境，建立了缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation, H/R）模型：将H9c2细胞在95%氮气（N₂）、5%二氧化碳（CO₂）、37°C的无糖平衡盐溶液中培养2小时，然后更换为完全培养基以模拟再灌注过程。 实验一，研究者检测了H/R刺激后H9c2细胞中PLK1的mRNA和蛋白质表达水平。 实验二，研究者用PLK1过表达腺病毒转染H9c2细胞，并在H/R处理后，利用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法检测细胞存活率；利用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中谷胱甘肽（Glutathione, GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPx）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）的水平；利用流式细胞术（Flow Cytometry）通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率，并用免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达。 实验三，为探究PLK1对线粒体自噬的影响，研究者用免疫印迹法检测了线粒体组分中LC3 II/LC3 I和Beclin1等线粒体自噬相关蛋白的表达。进一步，利用免疫荧光（Immunofluorescence）技术对线粒体外膜蛋白TOM20和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）进行共定位分析，以观察线粒体与溶酶体的融合情况。同时，通过ELISA试剂盒检测细胞内三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate, ATP）的生成水平。 实验四，为研究PLK1的下游作用机制，研究者首先通过免疫印迹法检测了H/R处理后H9c2细胞中磷酸化AMPK（p-AMPK）和总AMPK（AMPK）的表达水平。随后，使用AMPK抑制剂Dorsomorphin（又称Compound C）处理过表达PLK1的H9c2细胞，再行H/R处理，并检测p-AMPK和FUNDC1蛋白的表达变化。 实验五，为验证PLK1是否通过FUNDC1发挥作用，研究者利用慢病毒介导的短发卡RNA（shRNA）技术在过表达PLK1的H9c2细胞中沉默FUNDC1（shFUNDC1），然后进行H/R处理。通过流式细胞术检测细胞凋亡，并用免疫印迹法检测线粒体自噬相关蛋白LC3 II/LC3 I和Beclin1的表达变化。
四、主要研究结果与分析
结果一：缺血再灌注损伤抑制了PLK1的表达。 无论是大鼠心肌组织还是H9c2细胞模型，研究均一致显示，与假手术组或正常对照组相比，缺血再灌注损伤或H/R处理后，PLK1的mRNA和蛋白质水平均显著下降。这一发现首次明确了PLK1的表达在心肌缺血再灌注损伤中受抑制，为后续探究其潜在的保护作用提供了反向线索，成为整个研究的出发点。
结果二：过表达PLK1减轻了缺血再灌注引起的心肌梗死。 在大鼠模型中，过表达PLK1使缺血再灌注导致的心肌梗死面积显著缩小，且血清中心肌损伤标志物LDH的水平也明显降低。在H9c2细胞中，H/R刺激导致细胞存活率显著下降，而过表达PLK1可有效提高细胞存活率。同时，H/R刺激后细胞释放的抗氧化物质GSH、GPx和SOD水平下降，而过表达PLK1能逆转这一趋势，恢复其水平。这些结果表明，PLK1在整体动物水平和细胞水平上均能对抗I/R损伤，维持细胞活力和组织完整性，这为后续探索其保护机制奠定了功能性基础。
结果三：过表达PLK1减轻了心肌细胞凋亡。 在大鼠心肌组织中，TUNEL染色结果显示，过表达PLK1显著减少了缺血再灌注诱导的凋亡阳性细胞数量。免疫印迹数据显示，过表达PLK1组心肌组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，而促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Cleaved Caspase-3表达下调。在H9c2细胞中，流式细胞术和免疫印迹实验得到了完全一致的结果。这证实了PLK1的心肌保护作用是通过抑制细胞凋亡来实现的。
结果四：过表达PLK1诱导线粒体自噬并保护线粒体。 这是揭示PLK1作用机制的关键步骤。免疫印迹结果显示，在缺血再灌注的大鼠心肌和H/R处理的H9c2细胞中，尽管损伤本身可能启动了部分自噬反应，但过表达PLK1后，线粒体自噬相关蛋白LC3 II/LC3 I（尤其是线粒体组分中的LC3 II）和Beclin1的表达水平显著进一步升高。免疫荧光共定位实验直观地展示了，在过表达PLK1的H9c2细胞中，代表线粒体的TOM20信号与代表溶酶体的LAMP1信号重叠显著增加，说明线粒体被溶酶体吞噬的线粒体自噬过程被显著激活。相应地，ELISA检测发现，H/R刺激后细胞内ATP生成量下降，而过表达PLK1则可挽救ATP的生成水平。这一系列结果表明，PLK1通过强力诱导线粒体自噬来清除受损线粒体，恢复线粒体功能，从而保护心肌细胞。
结果五：过表达PLK1激活p-AMPK/FUNDC1信号通路。 在明确了PLK1诱导线粒体自噬后，研究者进一步探索了其上游调控信号。免疫印迹结果显示，过表达PLK1可显著上调H/R处理的H9c2细胞中p-AMPK的水平，说明PLK1促进了AMPK的磷酸化激活。同时，其下游分子FUNDC1的表达也随之升高。当使用AMPK抑制剂Dorsomorphin处理后，PLK1过表达所诱导的p-AMPK和FUNDC1蛋白表达上调均被显著抑制。这有力地证明了PLK1是通过激活AMPK来上调FUNDC1表达的。
结果六：抑制FUNDC1废除了PLK1过表达的线粒体自噬和抗凋亡作用。 作为机制链条的最后一环，研究者发现，在过表达PLK1的H9c2细胞中敲低FUNDC1后，PLK1所带来的抑制细胞凋亡的保护效应被完全逆转。同时，免疫印迹结果显示，PLK1过表达所诱导的LC3 II/LC3 I和Beclin1表达升高也被FUNDC1的敲低所抵消。这最终证实，PLK1的心肌保护作用及其对线粒体自噬的诱导，是依赖于FUNDC1受体的。
五、研究结论与价值
本研究综合以上结果，得出明确结论：PLK1通过激活p-AMPK/FUNDC1信号通路来诱导线粒体自噬，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。具体来说，过表达PLK1能促进AMPK磷酸化（p-AMPK），继而上调线粒体自噬受体FUNDC1的表达，最终激活线粒体自噬过程，清除受损的线粒体，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌组织。
此项研究具有重要的科学意义和应用价值。在科学层面，它首次揭示了PLK1在心肌缺血再灌注损伤中的保护性角色，并完整地阐明了“PLK1—p-AMPK—FUNDC1—线粒体自噬”这一全新的分子信号通路和调控机制，为理解心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程提供了新见解。在应用价值层面，该研究为临床治疗心肌缺血再灌注损伤提供了PLK1和FUNDC1这两个潜在的关键新靶点，为开发新的治疗药物或干预策略指明了方向。
六、研究亮点