本研究由Minjee Kim和Hanul Choi作为共同第一作者，Young Bong Kim作为通讯作者，来自韩国建国大学生物医学科学与工程系完成。该研究于2021年5月3日在线发表于European Journal of Pharmacology期刊第904卷，文章编号174144。

一、研究背景与目的

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种蚊媒传播的黄病毒，1947年在乌干达首次分离。近年来，由于先天性寨卡综合征（congenital Zika syndrome, CZS）的暴发，该病毒引起了全球关注。CZS以小头畸形、神经系统并发症和胎儿死亡为特征，世界卫生组织已将其列为国际关注的突发公共卫生事件。然而，目前尚无针对ZIKV的特异性治疗药物，现有的策略仅针对症状和传播预防。因此，开发有效的抗ZIKV治疗候选药物迫在眉睫。

姜黄素（curcumin）是姜黄的一种成分，常用于炎症和代谢综合征的管理。近期研究表明，姜黄素对登革病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、基孔肯雅病毒和寨卡病毒均具有抗病毒活性。虽然已有报道显示姜黄素的抗病毒作用主要集中在包膜病毒与细胞表面的结合阶段，但其针对ZIKV的具体治疗靶点和分子机制尚待阐明。本研究旨在整合网络药理学、分子对接和体外抗病毒实验，系统揭示姜黄素抗ZIKV的潜在靶点和生物学机制。

二、研究流程与实验设计

本研究分为三大流程：网络药理学分析、分子对接模拟和体外实验验证。

网络药理学分析：首先从DrugBank、GeneCards和NCBI数据库获取姜黄素相关治疗靶点，共鉴定出231个人类靶基因。同时从DisGeNet和NCBI数据库获取ZIKV相关病理靶基因，共78个。将两组靶基因取交集，获得7个ZIKV相关的姜黄素靶点：AKT1、CTNNB1、HDAC8、HMOX1、PTEN、TNF和TP53。利用STRING数据库（版本11.0，置信度>0.7）构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并在Cytoscape（版本3.7.1）中可视化和分析节点的连接度。在ZIKV靶点PPI网络中，TP53连接度最高（15），其次为HSP90AA1（13）、CDK5RAP2、CEP63、DYNC1H1（12）等。在7个姜黄素相关ZIKV靶点中，6个靶点之间存在相互作用，其中TP53和AKT1连接度最高（5），TNF和PTEN连接度为4。使用DAVID（版本6.8）进行KEGG通路富集分析，发现子宫内膜癌和乙型肝炎为最显著的疾病相关通路。随后构建“化合物-疾病靶点-通路”（compound-disease target-pathway, C-D-P）网络，包含33个节点和81条边，其中PTEN在疾病靶点节点中连接度最高（14），TNF次之（8）。

分子对接模拟：从蛋白质数据库（PDB）获取TP53、AKT1、PTEN和TNF的三维结构，从PubChem获取姜黄素化学结构。使用PyRx（版本0.9.6）和AutoDock Vina（版本1.1.2）进行配体-靶点对接，以结合亲和力评分评估相互作用强度。结合亲和力值越低，表明配体与靶蛋白结合越强。结果显示，姜黄素与TNF的结合亲和力最强（-8.7 kcal/mol），其次为AKT1（-7.8 kcal/mol）、PTEN（-7.4 kcal/mol）和TP53（-6.1 kcal/mol）。进一步使用Discovery Studio Visualizer分析姜黄素与TNF的相互作用模式，发现二者通过五个氢键稳定结合，关键残基包括两个Gln102（氢键）、Ser99、Glu116和Tyr115（碳氢键）。其他参与相互作用的残基有Pro100（酰胺-π堆积）、Lys98（烷基）和Glu116（π-阴离子）。

体外实验验证：使用非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和ZIKV MR766株。首先检测姜黄素对Vero细胞的细胞毒性，测得半数细胞毒性浓度（CC50）为100.2±0.512 μM，因此后续实验使用低于100 μM的浓度。抗病毒实验采用三种处理方式评估姜黄素的作用阶段：病毒附着阻断实验（4°C共处理1小时）、共处理实验（37°C共处理1小时）和感染后处理实验（先感染ZIKV 1小时，再加入姜黄素1小时）。每种处理后培养5天，使用EZ-Cytox试剂盒检测细胞存活率。此外进行了病毒滴度依赖性实验：Vero细胞与12.5 μM姜黄素及系列稀释的ZIKV（从1000 PFU起）在37°C共处理1小时，培养5天后测定细胞存活率。最后进行空斑减少实验：Vero细胞以3×10⁵细胞/孔接种于6孔板，与不同浓度姜黄素和50 PFU ZIKV在37°C、5% CO₂条件下共处理1小时，加入覆盖培养基培养5天，结晶紫染色后统计空斑数量。所有实验重复3次，使用SigmaPlot 11.0进行Student’s t检验，P值≤0.05为显著。

三、主要结果与数据支撑

网络药理学分析鉴定出7个ZIKV相关的姜黄素靶基因，其中TP53和AKT1在PPI网络中连接度最高，提示这两个靶点可能在姜黄素抗ZIKV机制中居于核心地位。KEGG通路富集分析显示这些靶点显著富集于癌症和病毒相关通路，尤其是子宫内膜癌和乙型肝炎通路，暗示姜黄素可能通过调控细胞存活、凋亡和炎症信号通路来发挥抗ZIKV作用。C-D-P网络中PTEN连接度最高，表明PTEN可能连接多个疾病通路，是姜黄素抗ZIKV网络中的枢纽节点。

分子对接结果中，姜黄素与TNF的结合亲和力最强（-8.7 kcal/mol），显著优于其他三个靶点。TNF分子上的Gln102、Ser99、Glu116和Tyr115等残基通过氢键与姜黄素形成稳定的空间构象，Pro100、Lys98和Glu116分别通过酰胺-π堆积、烷基和π-阴离子相互作用进一步稳定结合。这些结果提示TNF是姜黄素抗ZIKV最可能的直接作用靶点。

体外细胞毒性实验显示，姜黄素CC50为100.2 μM，表明在100 μM以下具有较好的安全性窗口。在抗病毒实验中，病毒附着阻断和共处理两种方式下，12.5至50 μM浓度的姜黄素均显著提高细胞存活率，呈剂量依赖性（P<0.05）。这一结果说明姜黄素在病毒感染的早期阶段——特别是病毒附着阶段——发挥抗病毒活性。而在感染后处理实验中，所有浓度下细胞存活率均低于40%，表明姜黄素不能抑制ZIKV的复制等晚期感染步骤。病毒滴度依赖性实验进一步证实，在病毒载量为15.6至250 PFU范围内，12.5 μM姜黄素可显著提高细胞存活率（P<0.05）；但当病毒载量达到500 PFU以上时，细胞存活率低于50%，姜黄素的保护效果被高病毒载量所抵消。空斑减少实验中，20-30 μM姜黄素可实现约100%的空斑减少，10 μM时减少率为52%，低于10 μM则无显著效果。这些定量数据综合证明了姜黄素在12.5至50 μM浓度范围内具有明确的抗ZIKV效力，且其作用窗口主要在病毒进入细胞的附着阶段。

四、结论与科学及临床价值

本研究首次通过网络药理学和分子对接揭示了姜黄素抗ZIKV的四个关键靶点——TP53、AKT1、PTEN和TNF，其中TNF与姜黄素的结合亲和力最强。体外实验证实姜黄素在早期病毒感染阶段（特别是病毒附着阶段）发挥显著的抗ZIKV活性，且在12.5-50 μM范围内呈剂量依赖性。本研究从“化合物-靶点-通路”的多层次角度阐明了姜黄素抗ZIKV的潜在机制，为姜黄素作为抗ZIKV治疗药物提供了理论依据。TNF作为炎症的重要介质，在ZIKV感染引起的神经炎症中被上调；姜黄素早期抑制TNF可能减少神经炎症，从而预防慢性神经系统异常。此外，TNF超家族成员也被证明可促进丙型肝炎病毒进入细胞，进一步支持姜黄素通过TNF抑制病毒入侵的假说。鉴于TNF阻断剂成本高昂（每人每年15,000-20,000美元）且有副作用，姜黄素作为一种天然、可口服、成本低廉的替代品，具有广阔的临床应用前景。考虑到姜黄素在人类饮食中的普遍存在和天然丰富性，本研究为应对未来ZIKV等全球病毒暴发提供了药物重定位的新策略。

五、研究亮点与特色

该研究的亮点在于三个方面：第一，首次整合网络药理学、PPI网络、KEGG通路富集和分子对接等多种计算手段，系统预测姜黄素抗ZIKV的靶点和通路，构建了C-D-P网络，从系统层面阐明了姜黄素的多靶点作用机制。第二，通过三种不同处理方式的抗病毒实验精细区分了姜黄素作用于病毒附着、融合还是复制阶段，实验设计严谨且具有机制解析能力。第三，研究对象姜黄素为天然膳食成分，具有安全性高、成本低、易于获取的优势，为ZIKV感染提供了可行的药物重定位方案。此外，本研究还通过空斑减少实验定量确认了姜黄素的抗病毒效力，并给出了明确的浓度-效应关系，为后续剂量优化和临床转化提供了关键数据。然而，需要注意的是，高剂量姜黄素可能产生毒性和致癌效应，未来仍需进一步研究确定合适的临床剂量。