本项研究由Hopen K. Yang、Pragati K. Muthukumar与Wilfred Chen共同完成，所属机构为美国特拉华大学化学与生物分子工程系。该研究成果于2025年发表在*Nature Communications*期刊上。
这项研究属于合成生物学与蛋白质工程领域，旨在解决当前靶向蛋白质降解技术中存在的一个关键限制：静态性与不可调控性。生物蛋白降解靶向嵌合体（BioPROTAC）通过劫持细胞内的泛素-蛋白酶体系统来特异性降解目标蛋白，在基础研究和疾病治疗中展现出巨大潜力。然而，现有的BioPROTAC系统通常是“始终开启”的，只能实现蛋白质的持续耗竭，缺乏条件性的“开/关”控制以及在不同目标蛋白之间进行切换的能力。这种静态特性使得无法对细胞生存必需的蛋白质进行可控的干预，也限制了构建复杂、动态的蛋白质调控网络。因此，研究者们提出，开发一个可逻辑门控、可切换的靶向蛋白质降解框架，对于精确研究蛋白质功能、开发动态治疗策略至关重要。研究的核心目标，是创建一种合成生物学工具，能够利用外部输入信号，对BioPROTAC的活性和靶向特异性进行可逆和逻辑化的调控。
为实现这一目标，研究团队设计并构建了一个名为LASER的逻辑门控蛋白质降解平台。整个研究的详细工作流程如下：
1. 核心工具的选定与验证：Sortase A (SrtA)的工程化与应用 研究选择了一种名为分选酶A（SrtA）的细菌转肽酶作为核心调控开关。传统的SrtA催化蛋白质连接反应，但本研究创新性地同时利用了其蛋白切割功能和连接功能。为了在哺乳动物细胞内高效工作，研究采用了钙离子非依赖性且活性显著增强的金黄色葡萄球菌SrtA七重突变体（SrtA7+）。首先，研究团队在HeLa细胞中验证了SrtA7+的细胞内活性。他们构建了基于splitFAST荧光报告系统的验证体系。splitFAST是两个分开表达的蛋白片段，当它们通过SrtA介导的连接反应共价结合时，才能结合染料HMBR发出荧光。反之，将完整的FAST蛋白中间插入SrtA识别序列，则SrtA的切割会使其失活。实验结果表明，在SrtA7+存在时，成功实现了splitFAST片段的连接（荧光开启）和完整FAST蛋白的切割（荧光关闭），从而在活细胞内确证了SrtA7+高效且可逆的切割与连接双重功能。
2. 利用SrtA实现靶向蛋白质降解的“关闭”与“开启”控制 验证了SrtA工具后，研究将其应用于调控Affinity-directed Protein Missile (AdPROM) 这一BioPROTAC系统。AdPROM由招募E3泛素连接酶的VHL结构域和识别目标蛋白的设计结合蛋白（DBP，如抗GFP的纳米抗体）组成。 * “关闭”控制：研究团队在AdPROM的连接区插入SrtA切割识别基序（LPETGG），构建了AdPROM-SrtA。在默认状态下，它能有效降解带有SH2结构域的GFP报告蛋白（SH2-GFP）。当共表达SrtA7+时，AdPROM-SrtA被切割成两部分，功能失活，从而拯救了SH2-GFP的荧光信号。而共表达无关的烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）则无此效果。这一结果通过流式细胞术和蛋白质印迹分析得到证实。 * “开启”控制：研究设计了“分裂式”AdPROM-SrtA系统，将VHL结构域（带有C端LPETGG标签）和DBP（如抗GFP纳米抗体，带有N端三甘氨酸标签）分开表达。两者单独存在时无活性。只有当SrtA7+存在时，它才能催化这两个片段连接成完整的、有功能的AdPROM，从而启动对SH2-GFP的降解。实验发现，为了驱动有效的连接和降解，需要过量表达带有三甘氨酸标签的DBP片段（质粒转染比例>5:1）。此外，研究还通过更换DBP（如将抗GFP纳米抗体替换为抗SH2的单抗体），证明了该“开启”策略具有普适性和靶向特异性。
3. 实现SrtA介导的细胞内靶向重定向 这是本研究最具创新性的环节之一。研究者将SrtA的切割与连接功能耦合，实现了在同一个细胞体系内，将降解目标从一个蛋白质切换到另一个蛋白质。具体流程是：先表达一个靶向YFP的全长AdPROM-SrtA，同时表达一个带有三甘氨酸标签的、靶向SH2的备用DBP（gGG-αSH2）。在默认状态下，只有YFP被降解。当引入SrtA7+时，它一方面切割靶向YFP的AdPROM-SrtA，解除对YFP的降解；另一方面，利用切割后VHL片段新暴露的LPETGG基序，与备用的gGG-αSH2进行连接，组装成一个全新的、靶向SH2-mScarlet-I（文中为SH2-miRFP670）报告蛋白的AdPROM。实验数据清晰地显示，在SrtA7+存在下，YFP信号得到拯救，而SH2-mScarlet-I信号则被显著降低，成功实现了降解靶标在两个不同报告蛋白之间的“切换”。
4. 整合蛋白酶门控，实现逻辑门控的靶向蛋白质降解 为了引入更复杂的调控逻辑，研究团队在SrtA连接功能的基础上，叠加了一层蛋白酶控制。他们在备用DBP（如gGG-αSH2）的N端三甘氨酸标签前，添加了一个TEVp的切割肽段（ENLYFQ|G）和一个荧光蛋白Electra2作为空间屏蔽块。这样，三甘氨酸标签就被“掩蔽”了。只有TEVp先切割移除这个屏蔽块，暴露出自由的N端三甘氨酸，SrtA7+才能随后催化连接反应。这构成了一个严格的“与门”：同时需要TEVp和SrtA7+两个输入，才能生成有功能的AdPROM。实验表明，单独表达TEVp或SrtA7+均无法触发SH2-mScarlet-I的降解；只有两者共表达时，才观察到显著的降解效果。该逻辑门功能首先在一个基于split蛋白酶（SbmVp）和荧光素酶的报告系统中得到验证，然后成功应用于调控AdPROM的组装。
5. 集成构建最终的LASER平台 最后，研究将上述所有组件集成，构建了完整的“逻辑门控AdPROM部署SrtA介导元件重组”平台，即LASER。该系统包含：1) 一个靶向YFP的全长AdPROM-SrtA（默认状态下降解YFP）；2) 一个被TEVp切割位点掩蔽的、靶向SH2的备用DBP。通过输入不同的信号组合，可以实现三种截然不同的降解状态： * 仅输入TEVp：掩蔽被解除，但无SrtA进行连接，系统维持默认状态，仅降解YFP。 * 仅输入SrtA7+：切割默认的AdPROM-SrtA，解除对YFP的降解，但掩蔽的DBP未被激活，无法连接，YFP和SH2-mScarlet-I均不被降解（“安全模式”）。 * 同时输入TEVp和SrtA7+：先由TEVp解除掩蔽，再由SrtA7+执行切割与连接，实现靶向切换，降解目标从YFP转变为SH2-mScarlet-I。 流式细胞术的时间过程实验表明，这种状态切换在转染后16小时内即可发生。蛋白质印迹分析进一步在分子水平上证实了TEVp对掩蔽肽的切割、SrtA对默认AdPROM的切割以及新AdPROM的连接等关键步骤。
本研究的主要结论是，成功开发了一个高度模块化、可逻辑编程的合成生物学平台LASER，首次在哺乳动物细胞内实现了对靶向蛋白质降解的动态、可逆和多重逻辑控制。该平台的核心价值在于：科学价值上，它将蛋白质水平的转录后调控工具提升到了逻辑电路的高度，为在活细胞内构建复杂的信号处理和执行系统提供了新范式；应用价值上，它使得研究者能够以前所未有的精度操控细胞内多种内源蛋白质的水平，这对于研究必需蛋白的功能、解析蛋白质网络的动态相互作用、开发条件激活的智能疗法（如仅在特定病理信号共存时才降解致病蛋白）以及细胞工厂的代谢通路动态优化等领域具有广阔前景。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，方法学的重大创新：创造性且系统性地利用了SrtA的双重酶活功能（切割与连接）作为可逆调控开关，这一思路超越了以往仅关注其连接功能的常规应用。第二，功能的突破性扩展：实现了从简单的“开/关”控制，到“靶标切换”，再到“逻辑门控”的多层次、可编程蛋白质降解，显著拓展了靶向蛋白质降解技术的操作空间和应用场景。第三，平台的强大灵活性与通用性：LASER平台具有高度模块化特性，其VHL E3连接酶招募模块、可交换的DBP模块以及输入响应模块（SrtA、TEVp等）均可根据需求进行更换或适配。文中已展示其兼容不同的DBP和报告系统，未来可轻松扩展至更多内源性靶蛋白和其他输入信号（如通过拆分TEVp实现小分子或光控输入）。第四，解决了关键挑战：成功实现了对蛋白质降解的条件性控制，为研究那些全局敲除会导致细胞死亡的必需蛋白的功能提供了可能，这是传统静态降解技术或基因敲除技术难以实现的。总而言之，LASER平台代表了合成生物学与靶向蛋白质降解领域的一次重要融合与推进，为在活细胞中进行动态、精确的“蛋白质组工程”奠定了强大的技术基础。