本研究的通讯作者为重庆医科大学附属儿童医院的董志芳（Zhifang Dong）、叶红（Ye Hong）及重庆医科大学基础医学院的何桂琼（Guiqiong He）。第一作者为易丽琳（Lilin Yi）。该研究于2025年5月1日在线发表于《Experimental & Molecular Medicine》期刊，题为“ELK1 inhibition alleviates amyloid pathology and memory decline by promoting the SYVN1-mediated ubiquitination and degradation of PS1 in Alzheimer’s disease”。
该研究属于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）发病机制与治疗靶点研究领域。AD是老年人群中最常见的痴呆类型，其主要病理特征包括由β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑、由异常过度磷酸化tau蛋白组成的神经原纤维缠结，以及突触和神经元丢失。Aβ由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）依次经β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶切割产生。γ-分泌酶复合体包含早老素1（presenilin 1，PS1）等四个亚基，其中PS1在催化底物裂解生成Aβ过程中发挥关键作用。已有研究表明，细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）在AD中异常过度活化，而ELK1是ERK1/2的重要下游靶标，通常经Ser383和Ser389位点磷酸化而被激活。ELK1在包括AD在内的多种神经退行性疾病中可能表达升高，但其在AD病理过程中的具体作用与机制尚不清晰。基于此，该研究的目的是明确ELK1是否参与AD的发病过程，并揭示其调控APP淀粉样蛋白剪切及Aβ生成的分子机制。
研究主要分四个层面展开，研究流程逐步递进。首先，研究者在AD患者脑组织、AD模型小鼠及AD细胞模型中检测ELK1表达水平。具体地，利用蛋白质免疫印迹（western blot，WB）检测AD患者海马组织中ELK1蛋白水平，并与年龄匹配的对照个体比较；利用WB和免疫荧光染色检测APP23/PS45双转基因AD模型小鼠海马组织中ELK1的表达；在稳定表达人瑞典突变型APP695的N2a细胞（N2aAPP）及共同稳定转染APP695与BACE1的HEK293细胞（2EB2）中检测ELK1蛋白水平；另外，用不同浓度Aβ1-42肽处理N2a和HEK293细胞以建立急性AD细胞模型。结果显示，AD患者海马组织中ELK1蛋白水平显著升高；6月龄AD模型小鼠海马组织中ELK1蛋白水平升高且在海马DG、CA1和CA3区域免疫荧光信号增强；N2aAPP和2EB2细胞中ELK1蛋白水平明显高于对照细胞；Aβ1-42肽以浓度依赖方式上调N2a与HEK293细胞中ELK1表达。这些结果确立了ELK1在AD患者、模型小鼠和模型细胞中普遍升高的现象。
其次，研究者在N2aAPP和2EB2细胞中通过基因操作改变ELK1表达水平，观察其对APP加工过程的影响。向N2aAPP细胞转染ELK1过表达质粒或ELK1短发夹RNA（shELK1）质粒，48小时后用WB检测相关蛋白。结果发现，敲低ELK1可显著降低PS1全蛋白、PS1氨基端片段（PS1-NTF）及PS1羧基端片段（PS1-CTF）水平，但不影响APP、BACE1、NCT、APH1A和PEN2的表达；ELK1过表达则对γ-分泌酶复合体各组分均无显著影响。2EB2细胞中也得到一致结果，ELK1敲低显著降低PS1水平，而过表达无明显作用。由于ELK1主要作为转录因子发挥作用，研究者进一步检测了其对PS1信使RNA（mRNA）水平的影响，结果发现无论是敲低还是过表达ELK1均不影响PS1的mRNA水平，提示ELK1并非通过转录调控影响PS1表达。
随后，研究者探究ELK1是否影响PS1的蛋白降解。先用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂氯喹处理N2aAPP细胞，发现MG132可显著升高PS1蛋白水平，而氯喹无此效应，说明PS1主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。通过共转染PS1-Flag和泛素-HA质粒并进行免疫共沉淀，证实PS1可发生多聚泛素化；将泛素不同赖氨酸位点突变为精氨酸后发现，仅K27位点突变可降低PS1多聚泛素化，进一步用仅保留单个赖氨酸的泛素突变体验证，PS1主要发生K27连接的多聚泛素化。通过构建PS1的赖氨酸位点突变体，确定K314为PS1的主要泛素化位点。在放线菌酮（cycloheximide，CHX）抑制蛋白合成后，ELK1过表达可明显延缓PS1降解并降低PS1泛素化水平，说明ELK1通过抑制PS1泛素化与降解来维持PS1蛋白水平。
第三部分工作聚焦于确定负责PS1泛素化降解的E3泛素连接酶，并阐明ELK1与E3连接酶的关系。根据UbiBrowser数据库预测，SYVN1是最可能的PS1 E3泛素连接酶。通过内源和外源免疫共沉淀实验，证实SYVN1可与PS1相互作用，而NEDD4L不能。SYVN1过表达可加速PS1降解并增加PS1泛素化；SYVN1特异性抑制剂LS-102处理可显著升高PS1蛋白水平。研究者进一步发现，ELK1可与PS1相互作用，且过表达ELK1可削弱PS1与SYVN1的结合，并减弱SYVN1介导的PS1泛素化。在shELK1转染基础上加入LS-102，可逆转shELK1引起的PS1表达降低。这些结果表明ELK1通过竞争性抑制PS1与SYVN1的相互作用，从而抑制SYVN1介导的PS1泛素化与降解。
第四部分在体内验证ELK1敲低对AD小鼠病理和认知功能的影响。2月龄APP23/PS45小鼠海马CA1区注射携带shELK1的腺相关病毒（AAV-shELK1），5月龄时进行行为学评价和病理检测。结果显示，AD小鼠海马中ELK1、APP、BACE1、PS1和β-CTFs蛋白水平显著升高，而AAV-shELK1敲低ELK1可逆转BACE1和PS1的升高，但不影响APP和β-CTFs。此外，ELK1敲低可显著降低Aβ40和Aβ42水平及海马老年斑数量。在Barnes迷宫和Morris水迷宫测试中，AD小鼠表现出空间学习与记忆障碍，ELK1敲低可缩短逃避潜伏期、增加目标区域探索次数及准确度，恢复至对照组水平。电生理记录显示AD小鼠海马CA1区长时程增强（long-term potentiation，LTP）显著受损，而ELK1敲低可逆转LTP损伤。
第五部分探究ELK1磷酸化在PS1泛素化降解中的作用。研究发现AD小鼠海马及N2aAPP细胞中磷酸化ELK1（p-ELK1）水平显著升高，Aβ1-42处理以浓度依赖方式上调p-ELK1。使用ELK1磷酸化抑制肽TAT-DEF-ELK1（TDE）处理N2aAPP细胞可显著降低PS1表达。免疫共沉淀实验表明，磷酸化模拟体p-ELK1与PS1的结合能力强于未磷酸化ELK1；过表达p-ELK1比过表达ELK1更显著地抑制PS1泛素化，而TDE处理可恢复PS1泛素化水平。在存在SYVN1的情况下，p-ELK1同样表现出更强的抑制PS1泛素化效应，TDE则能完全恢复该泛素化水平。这说明ELK1尤其是其磷酸化形式对SYVN1介导的PS1泛素化与降解至关重要。
第六部分在体内评估TDE对AD小鼠的治疗效果。2月龄AD小鼠每日腹腔注射TDE（8 mg/kg）至行为学实验结束。TDE处理可显著降低AD小鼠海马PS1表达，但不影响APP、BACE1和β-CTFs；同时显著降低Aβ40和Aβ42水平及老年斑数量。行为学测试中，TDE可缩短AD小鼠在Barnes迷宫和水迷宫中的逃避潜伏期，提高记忆提取表现，并恢复海马CA1区LTP。TDE对野生型小鼠的运动能力、焦虑样行为及体重等无明显不良影响。
该研究的结论是：ELK1在AD中异常升高，尤其是其磷酸化形式p-ELK1。ELK1通过竞争性抑制PS1与其E3泛素连接酶SYVN1的相互作用，抑制SYVN1介导的PS1泛素化与降解，从而增加γ-分泌酶活性，促进Aβ生成和老年斑形成，最终导致突触和认知功能障碍。遗传敲低或药理学抑制ELK1可通过促进PS1泛素化降解来减轻AD病理和记忆损害，提示ELK1可能是AD治疗的新靶点。
该研究的亮点包括：首次揭示ELK1在AD患者及多种AD模型中异常升高；发现PS1主要发生K27连接的多聚泛素化且其关键位点为K314；鉴定SYVN1为PS1的新型E3泛素连接酶；阐明ELK1通过非转录机制调控PS1蛋白稳定性的新功能；证实抑制ELK1磷酸化的TDE肽在AD小鼠中具有治疗潜力。研究价值在于将ERK1/2信号通路与PS1蛋白降解直接联系起来，为理解AD的发病机制提供了新视角，并为开发以ELK1为靶点的AD治疗策略奠定了实验基础。