Aggregatibacter actinomycetemcomitans血清型b分离株的cagE基因分型及其在瑞典牙周炎患者中的潜在风险评估价值
作者与发表信息
本研究由Anders Johansson、Rolf Claesson、Carola Höglund Åberg、Dorte Haubek、Mark Lindholm、Sarah Jasim和Jan Oscarsson合作完成。作者单位包括瑞典于默奥大学牙科学院分子牙周病学系（Division of Molecular Periodontology, Department of Odontology, Umeå University）、于默奥大学牙科学院口腔微生物学系（Division of Oral Microbiology, Department of Odontology, Umeå University），以及丹麦奥胡斯大学牙科与口腔健康系儿童牙科部（Section for Pediatric Dentistry, Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University）。通讯作者为Jan Oscarsson。这项研究于2019年9月17日发表在期刊 Pathogens 上（2019, 8, 153）。
学术背景
本研究属于口腔微生物学与牙周病学交叉领域，重点关注牙周炎相关病原体——伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans， 简称Aa）。Aa是一种革兰氏阴性机会性致病菌，与侵袭性牙周炎以及心内膜炎等全身性疾病密切相关。纵向研究表明，携带Aa的青少年发生牙周附着丧失（Attachment Loss, AL）的风险显著增高。
Aa具有高度的遗传多样性，拥有多种血清型（a-g）和基因型。其中，血清型b的JP2基因型因其白细胞毒素（Leukotoxin, LtxA）基因启动子区域存在530碱基对（bp）的缺失而具有高白细胞毒性，已被确认为青少年牙周炎进展的重要风险标志物。然而，除了JP2基因型，还存在一部分非JP2基因型的血清型b菌株，它们同样表现出高白细胞毒性和与疾病进展的强关联，但缺乏JP2特有的启动子缺失，因此需要一个更广泛的遗传标记来识别这类高毒力菌株。
先前在加纳青少年纵向队列中的研究发现，一个名为*cagE*的基因可能作为识别高白细胞毒性的JP2及非JP2基因型血清型b菌株的诊断标记。*cagE*基因编码的蛋白质N端与IV型分泌系统（Type IV Secretion System, T4SS）蛋白VirB1同源，C端与VirB4同源，推测可能是这两个基因融合的产物。携带*cagE*（cagE+）的菌株与牙周附着丧失的进展相关。
基于以上背景，本研究旨在验证*cagE*基因分型在另一个独立人群——瑞典牙周炎患者中的适用性。具体目标包括：1）确定*cagE*基因在瑞典患者分离的血清型b Aa菌株中的流行率；2）探讨*cagE*与染色体上*virB1/virB4*基因的携带是否存在反向关系；3）评估cagE+菌株在龈下菌斑样本中的比例及其与患者年龄的关联，以进一步确认其作为牙周炎风险诊断标记的潜力。
详细工作流程
本研究是一项回顾性的实验室基因型分析研究，主要基于已建立的菌株库和先前收集的临床数据进行。其工作流程可分为以下几个步骤：
第一步：菌株与临床数据收集 研究团队利用了一个在过去15年（2000-2014年）间建立的、来自瑞典牙周炎患者的Aa菌株库。这些菌株来源于转诊至专科诊所（包括于默奥牙科学校的牙周病专科诊所及其他瑞典各地的专科诊所）的患者的龈下菌斑样本。患者被简单地分为年轻组（≤35岁）和年长组（>35岁），这是基于早期对早发性牙周炎的定义。通过对3459份样本的分析，共分离出347株Aa。通过聚合酶链式反应（PCR）血清分型，其中118株（34.0%）被鉴定为血清型b。这118株血清型b菌株中，有17株（14.4%）被鉴定为JP2基因型（携带530 bp启动子缺失）。在本研究中，研究者成功培养了其中116株血清型b菌株（100株非JP2型，16株JP2型）作为主要分析对象。每株菌株都关联了对应的患者年龄组信息及其在原始龈下菌斑样本中占总可培养菌群（Total Viable Count, TVC）的比例数据。
第二步：参考菌株验证与PCR/定量PCR（qPCR）方法建立 为了验证并应用*cagE*和*virB4*基因的检测方法，研究首先使用了一组先前已完成全基因组测序的25株血清型b Aa参考菌株。这些菌株的*cagE*和*virB1/virB4*状态已知。研究者采用常规PCR和qPCR技术，使用特异性引物对*cagE*基因和*virB4*基因进行扩增检测。结果显示，所有cagE+菌株（均属于任意引物PCR [AP-PCR]基因型1）均未检测到染色体编码的*virB1*和*virB4*基因；而所有cagE-菌株（属于AP-PCR基因型2或其他型）均携带染色体*virB1*和*virB4*基因。这一结果证实了检测方法的有效性，并初步揭示了*cagE*与染色体*virB1/virB4*基因携带之间的反向互斥关系。基于此，后续对主要菌株库的筛查将主要聚焦于*cagE*和*virB4*。
第三步：对瑞典患者菌株库进行基因分型筛查 研究团队利用建立好的qPCR方法，对116株来自瑞典患者的血清型b Aa菌株进行了系统的*cagE*和*virB4*基因筛查。同时，结合这些菌株已知的AP-PCR基因型（分为型1、型2和其他[3-11型]）和JP2基因型状态，进行综合分析。所有菌株的DNA模板通过煮沸新鲜菌落制备。qPCR反应使用Kapa SYBR Fast qPCR试剂盒，在特定的循环条件下进行，通过检测特异性扩增片段的存在与否来判断基因的携带情况。
第四步：数据关联与分析 将分子生物学检测结果（cagE状态、virB4状态、AP-PCR型别、JP2状态）与两类临床数据关联进行分析： 1. 与菌斑比例关联：比较cagE+菌株（n=49）与cagE-菌株（n=67）在它们各自来源的龈下菌斑样本中所占的TVC比例。 2. 与患者年龄关联：分析cagE+菌株在年轻患者组（≤35岁， n=62）和年长患者组（>35岁， n=54）中的流行率分布。
统计分析采用秩和检验（Rank test）比较菌斑比例的差异，并计算优势比（Odds Ratio, OR）及95%置信区间（CI）来评估cagE+状态与年轻患者之间的关联强度。
主要研究结果
1. *cagE*与*virB4*基因携带呈反向互斥关系 对116株瑞典来源的血清型b Aa菌株的筛查结果显示，49株（42.2%）为cagE阳性，67株（57.8%）为cagE阴性。所有cagE+菌株（100%）都属于AP-PCR基因型1，并且均不携带染色体上的*virB4*基因。在cagE-菌株中，有26株（占cagE-菌株的38.8%，占总数的22.4%）检测到染色体*virB4*基因。值得注意的是，有3株cagE+菌株检测到了*virB4*，但进一步的PCR分析表明，这些菌株的*virB4*基因很可能位于质粒上，而非染色体。因此，在染色体水平上，*cagE*与*virB4*基因的携带存在完全的反向关系（即没有一株菌同时携带这两个染色体基因）。这一结果强烈支持了*cagE*基因可能起源于*virB1*和*virB4*基因融合事件的假说。
2. cagE+菌株在龈下菌斑中占比更高 将菌株的基因型数据与其在原始菌斑样本中的比例关联分析后发现，携带cagE+菌株的患者样本中，Aa占总可培养菌群的比例显著高于携带cagE-菌株的患者样本（p < 0.001）。这表明cagE+菌株在牙周微环境中可能具有更强的定植或增殖能力。此外，在cagE+菌株内部，JP2基因型菌株与非JP2基因型菌株在菌斑中的比例没有显著差异，说明高比例这一特征与cagE状态相关，而非特异地与JP2启动子缺失相关。
3. cagE+菌株在年轻患者中流行率显著更高 年龄关联分析显示，cagE+菌株在年轻患者组（≤35岁）中的流行率（64.5%， 40/62）远高于在年长患者组（>35岁）中的流行率（16.7%， 9/54）。这一差异具有高度的统计学意义（p < 0.001， OR = 9.1， 95% CI: 3.8-22.0）。这一发现与先前在加纳青少年队列中的观察结果一致，进一步强化了cagE+菌株与早发性或侵袭性牙周炎风险的关联。
4. cagE作为高毒力血清型b菌株的标记 综合来看，所有JP2基因型菌株（n=16）均为cagE+。而cagE+菌群中还包含33株非JP2基因型菌株。这些cagE+的非JP2菌株与JP2菌株共享AP-PCR基因型1，且在菌斑比例和年轻患者偏好性方面表现相似。因此，*cagE*基因可以作为一个更广泛的遗传标记，用于识别一类具有高毒力潜能的血清型b Aa菌株，这类菌株包括经典的JP2基因型和一部分具有相似疾病关联性的非JP2基因型。
结论与意义
本研究得出以下核心结论： 1. 在瑞典牙周炎患者来源的血清型b伴放线聚集杆菌菌株中，*cagE*基因是一个常见的特征，流行率为42.2%。 2. *cagE*基因与染色体*virB1/virB4*基因的携带在血清型b菌株中呈反向互斥关系，这为“cagE是virB1和virB4基因融合产物”的进化假说提供了有力支持。 3. 携带*cagE*的菌株（包括JP2和非JP2型）在龈下菌斑中占比更高，且在年轻（≤35岁）牙周炎患者中流行率显著更高，这与它们在加纳人群中的表现一致。 4. 因此，*cagE*基因分型可作为一项有用的分子诊断工具，用于识别那些具有高毒力潜能、与牙周附着丧失进展风险相关的血清型b Aa菌株，其覆盖范围超越了传统的JP2基因型检测。
本研究的科学价值在于：首先，在独立于原始发现地（加纳）的瑞典人群中验证了*cagE*作为风险标记的有效性，增强了其普适性。其次，深化了对*cagE*基因起源的理解，将其与细菌的T4SS进化联系起来。应用价值在于为临床微生物诊断提供了一种新的PCR检测靶标，有助于更精准地识别出那些可能罹患侵袭性牙周炎的高风险个体（尤其是青少年），从而实现早期干预和个性化治疗。
研究亮点
其他有价值内容
研究在讨论部分提出了一个关于*cagE*和JP2基因型起源的假设性进化模型。研究者推测，一个共同的、cagE+的血清型b Aa祖先菌株可能已经具备了高白细胞毒性的特性。随后，在这个祖先谱系中，一部分菌株发生了*lxt*启动子区的530-bp缺失，从而产生了JP2基因型分支。而另一些未发生此缺失的菌株则保留了非JP2的cagE+基因型。这个模型很好地解释了为何JP2基因型总是与cagE共存，以及为何cagE+的非JP2菌株与JP2菌株在AP-PCR分型和临床表型上如此相似。这为理解这种重要牙周病原体的毒力进化提供了新的思路。