学术研究报告：磷酸肌酸挽救与肌酸激酶缺失相关的肠上皮代谢功能障碍并在小鼠结肠炎中具有保护作用

作者及机构
本研究由Geetha Bhagavatula（第一作者，科罗拉多儿童医院儿科消化、肝病与营养科）、Corey S. Worged等共同完成，通讯作者为Caroline H. T. Hall。合作机构包括科罗拉多大学消化与肝病科、黏膜炎症项目组及落基山退伍军人医院。论文发表于*Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology*（2025年7月9日），DOI: 10.1016/j.jcmgh.2025.101557。

学术背景

科学领域：炎症性肠病（IBD）的代谢机制与治疗策略。
研究动机：IBD患者肠道上皮中肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）表达显著降低，而CK是细胞能量代谢的核心酶，催化肌酸（Cr）与三磷酸腺苷（ATP）之间的高能磷酸盐双向转移。然而，CK缺失对肠上皮细胞（IECs）代谢和功能的影响尚不明确。
关键科学问题：
1. CK缺失如何导致IECs能量代谢缺陷？
2. 磷酸肌酸（Phosphocreatine, PCR）能否逆转这些缺陷？
3. PCR是否对IBD模型具有治疗潜力？

研究流程与方法

1. 构建CK缺失模型

• 细胞模型：
  
  • T84细胞：通过短发夹RNA（shRNA）敲低CK脑型亚基（CKB KD）。
    
  • 类器官模型：从CK双敲除（CKB/CKMT KO，简称CK DKO）小鼠结肠中提取并培养肠上皮类器官。
    
• 验证方法：定量PCR（qPCR）、免疫印迹（Western blot）确认CK表达缺失，并检测其他CK亚型（CKM、CKMT）及肌酸转运蛋白（CRT）的表达变化。
  

2. 代谢与功能表征

• 能量代谢分析：
  
  • 高效液相色谱（HPLC）：测定ATP、ADP、AMP、Cr和PCR水平。
    
  • Seahorse能量代谢分析仪：检测氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），评估氧化磷酸化和糖酵解能力。
    
  • 线粒体DNA含量：通过qPCR比较线粒体基因（tRNA-Leu）与核基因（β2-微球蛋白）的比值。
    
• 功能实验：
  
  • 增殖：DAPI核染色动态监测细胞数量；流式细胞术检测Ki67阳性率。
    
  • 屏障功能：跨上皮电阻（TEER）和荧光葡聚糖（FITC-dextran）渗透实验。
    
  • 伤口愈合：划痕实验量化修复速度。
    

3. PCR干预实验

• 体外补充PCR：在CK缺失模型中添加10 mM（T84）或1 mM（类器官）PCR，评估代谢与功能恢复。
  
• 体内治疗：
  
  • 小鼠结肠炎模型：葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导急性结肠炎，口服78 mM PCR（基于粪便和结肠组织PCR检测确定有效剂量）。
    
  • 评估指标：疾病活动指数（DAI）、组织病理学评分、结肠通透性（FITC-dextran血清渗透）、细胞因子水平（V-Plex多重免疫检测）。
    

主要结果

1. CK缺失导致能量危机：

   • CK DKO类器官和CKB KD T84细胞的ATP水平下降50%，氧化磷酸化能力降低（OCR减少30%），线粒体DNA含量减少（图2-3）。
     
   • 机制：CK缺失通过下调PGC-1α（线粒体生物发生关键调控因子）及其靶基因TFAM，抑制线粒体生成。
     

2. 功能缺陷：

   • 增殖减缓：CK DKO类器官的Ki67阳性细胞减少40%（图4B）。
     
   • 屏障形成延迟：TEER峰值降低25%，但紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-1/2）结构未受影响（图4D-H）。
     

3. PCR的挽救作用：

   • 代谢恢复：补充PCR使ATP水平恢复正常，OCR提升至野生型80%（图6E-F）。
     
   • 功能改善：增殖速率提高2倍，TEER完全恢复（图5A, 7A-B）。
     
   • 体内保护：口服PCR使DSS结肠炎的DAI评分降低35%，组织损伤减轻（图8E-F），且依赖CRT介导的PCR摄取（图6G）。
     

结论与意义

1. 科学价值：首次阐明CK缺失通过破坏线粒体能量供应导致IECs功能障碍，并提出“代谢-功能”轴是IBD的潜在治疗靶点。
   
2. 应用价值：口服PCR作为一种新型干预策略，可绕过CK缺失直接补充能量底物，为IBD患者提供个性化治疗方向。
   
3. 临床转化：PCR的安全性（小鼠无毒性）和有效性（78 mM剂量可达结肠）支持其进入临床前试验。
   

研究亮点

1. 创新模型：结合基因编辑类器官和永生化细胞，模拟人类IBD的CK缺失表型。
   
2. 多维度验证：从代谢组学（HPLC）、功能学（TEER、划痕）到体内模型（DSS结肠炎），系统解析CK-PCR通路的作用。
   
3. 转化医学贡献：首次证明口服PCR的生物利用度及其对结肠炎的保护效应，填补了CR代谢通路在IBD治疗中的空白。
   

其他价值：
- 发现CK缺失引发CRT表达下调，提示CRT是PCR疗效的限速因素（图1C-D）。
- 提出“能量代谢-免疫调节”交叉对话：PCR在野生型小鼠中上调IFN-γ，但在CK DKO中无此效应（图8J），暗示代谢缺陷可能独立于炎症信号。