学术报告：新型分子方法在白色念珠菌基因功能研究中的应用

本文由S. Theiß、G. A. Köhler（维尔茨堡大学感染研究中心）、M. Kretschmar、T. Nichterlein（曼海姆医学院医学微生物与卫生研究所）以及J. Hacker（维尔茨堡大学分子感染生物学研究所）合作完成，发表于2002年的期刊*Mycoses*（45卷，345-350页）。文章聚焦于针对人类致病真菌白色念珠菌（*Candida albicans*）的分子遗传学研究方法进展，尤其探讨了基因功能分析的技术创新及其在感染机制研究中的应用。

学术背景

白色念珠菌是临床研究中重要的机会性病原真菌，在免疫功能低下患者中常引发黏膜和深部组织感染。然而，其遗传操作难度大（如二倍体基因组、无已知有性生殖周期、非标准CUG密码子解码为丝氨酸而非亮氨酸），且传统方法依赖营养缺陷型菌株，限制了野生型菌株的研究。此外，唑类抗真菌药物的耐药性问题日益严峻，亟需深入理解毒力基因功能以开发新疗法。本文旨在总结近年来发展的分子工具，包括基因表达分析、定位技术和新型选择标记系统，并以ABC转运蛋白MLT1的功能研究为例，展示这些技术的应用价值。

主要技术进展

1. rrRNA定向原位杂交技术（Fluorescent in situ hybridization, FISH）
   该技术通过荧光标记的rrRNA探针快速（2.5小时）特异性识别患者组织或血液中的白色念珠菌，灵敏度与PCR-免疫分析相当，但成本更低且能直观显示真菌与组织背景的空间关系。例如，Lischewski等通过FISH在感染组织中成功区分*C. albicans*和*C. parapsilosis*。

2. 报告基因系统优化

   • 绿色荧光蛋白（GFP）：通过密码子优化（去除CTG密码子）和强启动子（如actin基因启动子）驱动，实现单拷贝整合后的稳定表达。GFP无需辅因子，可直接观察活细胞内蛋白定位。例如，MLT1转运蛋白与GFP的C端融合显示其定位于液泡膜，提示其可能参与代谢物运输或解毒功能。
     
   • 荧光素酶（RLuc）：无CTG密码子的*Renilla*荧光素酶基因可用于低背景报告系统。

3. 体内表达技术（In vivo expression technology, IVET）
   采用重组酶FLP介导的标记切除系统，动态监测感染过程中毒力基因（如SAP家族基因）的表达模式。例如，Staib等发现*SAP1-6*基因在小鼠食管和播散性感染中呈现阶段性激活。

4. 新型显性选择标记MPAR
   基于白色念珠菌肌苷单磷酸脱氢酶基因*IMH3*的突变体（MPAR），可在野生型菌株中通过抗霉酚酸（MPA）选择压力实现转化体筛选。MPAR标记的“blaster”策略（类似URA3-blaster）克服了传统营养缺陷型依赖的限制，成功用于MLT1基因的双等位基因敲除。

MLT1转运蛋白的功能研究案例

1. 蛋白定位：MLT1::GFP融合蛋白定位于液泡膜，结构与酵母Ycf1和Bpt1相似，提示其可能参与谷胱甘肽结合物的外排。
   
2. 基因敲除与表型分析：
   
   • 采用MPAR-blaster策略分两步敲除MLT1双等位基因，通过MPA敏感性筛选重组子。
     
   • 突变体在体外无显著表型，但小鼠腹腔感染模型中，肝脏损伤标志物丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性显著降低，组织学证实肝细胞侵袭能力减弱。回补实验证实MLT1单拷贝可恢复致病性。
     
3. 结论：MLT1通过液泡膜转运功能促进白色念珠菌在宿主体内的组织侵袭，尤其在播散性感染中起关键作用。

研究意义与亮点

1. 技术创新：MPAR标记系统突破了白色念珠菌遗传操作的瓶颈；GFP报告系统与IVET技术为动态研究毒力基因提供了工具。
   
2. 科学价值：揭示了ABC转运蛋白在真菌适应宿主环境中的作用，为抗真菌药物靶点开发提供新方向。
   
3. 应用潜力：FISH技术可加速临床念珠菌感染的诊断，而毒力基因调控机制的解析有助于设计针对性疗法。

未来展望

作者呼吁开发大规模功能基因组学技术（如转座子插入突变、双杂交系统），以应对白色念珠菌全基因组研究的挑战。本文展示的方法为后续研究奠定了技术基础，也为其他致病真菌的遗传学研究提供了借鉴。