BMP3影响小鼠皮质骨与松质骨长骨发育的研究报告

一、研究基本信息

本研究由Ivan Banovac、Lovorka Grgurevic、Viktorija Rumenovic、Slobodan Vukicevic和Igor Erjavec等人完成。其中Ivan Banovac和Lovorka Grgurevic来自克罗地亚萨格勒布大学医学院解剖与临床解剖学系，Viktorija Rumenovic、Slobodan Vukicevic和Igor Erjavec来自同一医学院转化与临床研究中心矿化组织实验室。该研究发表于International Journal of Molecular Sciences，2022年第23卷第785期，于2022年1月12日正式发表。

二、研究背景与目的

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）属于转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）蛋白超家族，在胚胎发育及出生后生长过程中对多种组织具有多效性调控作用。BMP3最早以osteogenin的名称从骨组织中分离获得，约占脱矿骨中BMP总量的65%。早期研究发现osteogenin能诱导成骨分化，但后续研究证实这是由于其含有其他BMPs的微量污染物所致，纯化的BMP3并不促进骨形成。进一步利用BMP3基因敲除小鼠（bmp3−/−）的研究表明，成年bmp3−/−小鼠骨量较野生型小鼠更多，支持BMP3作为骨密度负调控因子的作用。

此前研究主要关注BMP3对椎骨松质骨（trabecular bone）的影响，而对于长骨皮质骨（cortical bone）以及胫骨等下肢远端长骨的作用尚缺乏系统数据。此外，BMP3对不同性别及不同出生后发育阶段小鼠骨骼的影响也未见全面比较。因此，本研究旨在利用组织学和X射线显微计算机断层扫描（micro-CT）技术，对bmp3−/−小鼠在不同出生后阶段的长骨进行系统表征，以全面揭示BMP3在骨骼发育与代谢中的调控作用。

三、研究流程与实验方法

本研究采用了多种实验手段，从基因表达定位、早期骨骼发育观察、到青年期和成年期的骨微结构定量分析，形成了多层次的研究流程。

首先，研究者利用P0（出生当天）小鼠进行BMP3组织定位分析。由于bmp3−/−小鼠的BMP3基因第一外显子中插入了lacZ报告基因，可通过X-gal染色间接显示BMP3的表达部位。P0小鼠经深度乙醚麻醉后取材，组织样本经多聚甲醛固定、蔗糖梯度冷冻保护后，用OCT包埋并在−80°C冻存。随后使用冷冻切片机制备20微米厚的切片，进行标准X-gal染色和苏木精-伊红（H&E）染色，在光学显微镜下观察lacZ报告蛋白的分布。野生型小鼠作为对照，其X-gal染色完全阴性。

其次，为评估BMP3对早期骨骼发育的影响，研究者对出生后14天（P14）的雄性小鼠进行了差异性骨骼染色。小鼠经深度麻醉处死后，热水处理去除皮肤，去内脏及眼球，用福尔马林-醋酸-酒精溶液固定45分钟。软骨部分用阿尔新蓝（alcian blue）染色，骨组织用茜素红（alizarin red）染色。样本经氢氧化钾和甘油梯度脱色透明后，在立体显微镜下成像，观察矿化骨与软骨的分布差异。

第三，研究的主体部分为基于micro-CT的骨微结构定量分析。实验动物分为8周龄和16周龄两个年龄组，每个年龄组又分为雄性和雌性两个性别组。bmp3−/−小鼠各组样本量分别为：8周龄雄性4只、8周龄雌性4只、16周龄雄性6只、16周龄雌性6只，同时设置年龄和性别匹配的野生型对照组。取左侧后肢的股骨和胫骨，去除软组织后用4%甲醛固定48小时。使用SkyScan 1076 micro-CT扫描仪进行成像，参数设置为9微米各向同性体素、电压50 kV、电流200 μA、0.5毫米铝滤过片减少射束硬化效应，旋转步长0.5°、扫描范围198°。扫描数据用NRecon软件进行重建。

形态计量分析使用CTAn软件进行。松质骨分析区域为股骨远端和胫骨近端，以生长板为参考点，避开初级海绵骨（primary spongiosa），生长板下偏移50层开始，分析100层范围内的松质骨。皮质骨分析区域为股骨和胫骨中段骨干，偏移350层，分析50层范围。分析的皮质骨参数包括：骨体积分数（BV/TV）、骨髓腔体积（endosteal volume，EV）、皮质骨厚度（cortical thickness，Co.Th）和极惯性矩（polar moment of inertia，MMI）。松质骨参数包括：骨体积分数、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁模式因子（trabecular pattern factor，Tb.Pf）和结构模型指数（structure model index，SMI）。

第四，为验证micro-CT结果并观察生长板变化，对16周龄小鼠股骨进行了组织学和免疫组织化学分析。micro-CT扫描完成后，股骨样本用14% EDTA溶液脱钙28天，每两天更换一次脱钙液。脱钙标本石蜡包埋后纵向切成6微米厚切片。H&E染色后在光学显微镜下观察，使用ImageJ软件测量股骨远端生长板的总高度，沿生长板长度方向在10个不同位置测量，并计数生长板桥接元素（bridging elements）的数量和宽度。免疫组化采用热诱导抗原修复法，使用BMP2抗体和Runx2抗体评估骨组织中这两种蛋白的表达水平。

第五，在数据统计分析方面，采用GraphPad Prism 8.3.0软件。bmp3−/−组与野生型组之间使用非配对双尾Welch t检验比较，p<0.05为有统计学意义。生长板桥接元素数量比较采用Mann-Whitney检验。效应量采用Hedges’ g值评估，该指标提供标准化均数差，可在不同比较间评估效应大小。各形态计量参数间的关联性采用Pearson相关系数和简单线性回归分析，以判定骨体积分数的变化在多大程度上可由其他参数的变化所解释。

四、主要研究结果

在P0小鼠中，X-gal染色结果显示BMP3表达于骨组织、毛囊和肺中，肋骨、椎骨和颅骨中均可见蓝色信号，尤其在面颅骨和牙胚中表达最为明显。H&E染色显示bmp3−/−小鼠与野生型小鼠相比无发育缺陷。

P14小鼠的差异性骨骼染色显示，bmp3−/−小鼠长骨形态、大小和位置均正常，但茜素红在股骨远端和胫骨近端的积累较野生型更为显著，表明矿化沉积增强。最明显的差异出现在腓骨近端，所有野生型小鼠均可见矿化囊泡，而所有bmp3−/−小鼠均未观察到，这说明在P14阶段BMP3缺乏促进软骨向骨的转化和随后的骨矿化。

8周龄和16周龄小鼠的体重在bmp3−/−与野生型之间无显著差异。皮质骨分析显示，bmp3−/−小鼠股骨皮质骨体积分数在8周龄时最高高出野生型40%，16周龄时高出22%，所有组间差异均有统计学意义。骨皮质厚度在所有组中均显著增加。骨髓腔体积在bmp3−/−小鼠中较低，但仅在16周龄雌性小鼠中达到统计学显著。胫骨皮质骨体积分数在8周龄时约高出65%，16周龄时高出25%，除16周龄雌性小鼠外各组差异均显著。胫骨骨髓腔体积在所有bmp3−/−组中均显著降低。

松质骨参数变化更为突出。bmp3−/−小鼠股骨松质骨体积分数在8周龄时最高可达野生型的300%以上，16周龄时最高达200%以上，所有组间差异均显著。胫骨松质骨体积分数也呈现类似趋势。骨小梁数量在所有组中均显著增加，且与骨体积分数的变化趋势密切一致。骨小梁厚度仅在8周龄时显著增加，16周龄时反而略低于野生型但差异不显著。相关性分析显示，骨体积分数与骨小梁数量的相关系数高达0.986，线性回归显示骨体积分数97.2%的变异可由骨小梁数量预测；而骨体积分数与骨小梁厚度的相关系数仅为0.637，线性回归只解释了40.6%的变异。这表明bmp3−/−小鼠松质骨量的增加主要归因于骨小梁数量的增多，而骨小梁厚度的贡献较小。

皮质骨参数的相关性分析显示，骨体积分数与骨髓腔体积呈高度负相关（r=−0.830），与皮质骨厚度呈高度正相关（r=0.863），均具有统计学意义。

效应量分析（Hedges’ g）显示，bmp3−/−小鼠骨体积分数的增加在8周龄小鼠中比16周龄小鼠更为显著，说明BMP3缺乏对骨量的影响随年龄增长而有所减弱。此外，雌性小鼠中骨体积分数的增加幅度略大于雄性小鼠。

组织学分析进一步验证了micro-CT结果，16周龄野生型小鼠股骨远端骨小梁数量明显少于bmp3−/−小鼠。更重要的发现是，野生型小鼠的骺生长板（epiphyseal growth plate）中可见明显的矿化软骨桥接区域，而年龄匹配的bmp3−/−小鼠生长板中几乎未见软骨骨化和桥接现象。桥接元素区域的量化分析显示bmp3−/−小鼠显著减少。生长板总高度在两组之间无显著差异。免疫组化结果显示，bmp3−/−小鼠生长板肥大软骨细胞中BMP2和Runx2的表达均高于野生型。

五、研究结论与意义

本研究首次系统表征了BMP3基因缺失对长骨皮质骨和松质骨的影响，证实BMP3基因缺失导致股骨远端和胫骨近端的皮质骨和松质骨体积显著增加，进一步确认了BMP3在骨组织中的抑制性调控作用。骨矿化的增加在P14阶段即可观察到，骨体积的增加在8周龄和16周龄雌雄小鼠中均存在。皮质骨体积和厚度的增加主要源于骨髓腔内骨吸收的减少，而骨膜外成骨似乎未受明显影响。松质骨的增加则归因于BMP3对骺生长板中软骨向骨转化过程的抑制作用受损。BMP3通过对其他成骨性BMPs的拮抗作用防止骨的过度形成，并在骨对力学负荷的适应性反应中提供了生长因子表达与力学刺激之间的关联。

研究的科学价值在于填补了BMP3对长骨皮质骨尤其是胫骨作用的数据空白，同时系统比较了不同性别和不同发育阶段的影响差异，建立了从早期发育到成年期的完整表型数据。研究还揭示了BMP3缺乏延迟骺生长板矿化和桥接的新表型，为理解BMP3在软骨内成骨和生长板稳态维持中的作用提供了重要依据。

六、研究亮点

本研究的主要亮点包括：第一，首次全面表征BMP3对长骨皮质骨的影响，此前研究几乎仅关注松质骨；第二，首次比较了BMP3对胫骨近端这一负重部位的作用；第三，系统分析了性别和年龄因素对BMP3功能的影响，发现BMP3的基础抑制作用在雌雄小鼠中方向一致但效应大小存在差异；第四，发现了BMP3缺乏导致骺生长板桥接受阻的新表型，提示BMP3在生长板软骨矿化过程中发挥正调控作用，与既往认为BMP3单纯抑制骨形成的观点形成有趣的对比；第五，利用lacZ报告基因系统在蛋白水平上验证了BMP3的多个表达部位，为BMP3的功能研究提供了空间定位信息。