关于Heartland病毒GC糖蛋白融合后结构的学术研究报告

本文发表于*Journal of Virology*， 2018年1月，第92卷，第1期。研究由多名学者共同完成，主要作者包括Yaohua Zhu（中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室）、Yan Wu（中国科学院北京生命科学研究院健康与免疫研究网络）、Yan Chai、Jianxun Qi、Ruchao Peng（中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室），以及通讯作者Wen-Hai Feng（中国农业大学）和George Fu Gao（中国科学院微生物研究所、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等多机构）。

一、 研究学术背景 本研究属于病毒学与结构生物学交叉领域，聚焦于布尼亚病毒目（Bunyavirales）的膜融合机制。布尼亚病毒目包含多个病毒科，其中许多成员是重要的人类病原体，如引起严重发热伴血小板减少综合征的SFTS病毒（SFTSV）和引起肾综合征出血热的汉坦病毒（Hantavirus）。国际病毒分类委员会（ICTV）近期对布尼亚病毒进行了重新分类，设立了包括内罗病毒科（Phenuiviridae）和汉坦病毒科（Hantaviridae）在内的多个新科。然而，支持这种科级分类的分子结构证据尚不充分。

Heartland病毒（HRTV）是近年来在美国发现的一种由蜱虫传播的新型人畜共患病原体，属于内罗病毒科（Phenuiviridae）的白蛉病毒属（Phlebovirus）。与同科的SFTS病毒类似，HRTV能导致人类严重疾病。病毒进入宿主细胞依赖于其包膜糖蛋白Gn和Gc，其中Gc是介导病毒包膜与宿主细胞内体膜在低pH条件下发生融合的关键蛋白，属于II类膜融合蛋白。此前，已有关于SFTSV（内罗病毒科）以及汉坦病毒（如汉滩病毒HTNV和普马拉病毒PUUV，汉坦病毒科）Gc蛋白融合后（postfusion）结构的报道，但HRTV的Gc结构尚未解析。

本研究旨在解析HRTV Gc蛋白的融合后晶体结构，并通过与内罗病毒科（SFTSV）及汉坦病毒科（HTNV, PUUV）的Gc结构进行比对，从结构生物学角度探究两个病毒科之间膜融合机制的异同，从而为ICTV最新的分类学修订提供直接的结构证据。研究的核心目标是揭示布尼亚病毒科一级的“家族特异性”（family specificity）结构特征，深化对这类病毒入侵机制的理解。

二、 详细研究流程 本研究是一个典型的结构生物学研究，主要流程包括蛋白表达与纯化、晶体生长与数据收集、结构解析与精修，以及后续的详细结构比对与功能分析。

1. 蛋白表达与纯化：

   • 研究对象： HRTV Gc蛋白的胞外域（Ectodomain，残基567-999），去除了靠近C端跨膜区的茎部区域。
   • 表达系统： 采用杆状病毒-昆虫细胞（Baculovirus-insect cell）表达系统。将密码子优化后的HRTV Gc胞外域基因克隆至pFastBac1载体，N端带有gp67信号肽以便分泌，C端带有6×His标签便于纯化。
   • 纯化流程： 收获感染48小时后的Hi5细胞上清液。首先使用镍柱（HisTrap HP column）进行金属亲和层析，初步纯化带His标签的Gc蛋白。随后，使用分子排阻色谱（Superdex 200 ¹⁰⁄₃₀₀ GL column）进行进一步精细纯化，缓冲液为pH 8.0的Tris-HCl。最终将蛋白浓缩至5 mg/mL用于结晶筛选。

2. 晶体生长与数据收集：

   • 结晶方法： 采用坐滴气相扩散法，在18°C下进行。将1 μL蛋白溶液与1 μL储液混合。最终获得晶体的条件为：6% (v/v) 异丙醇，0.1 M 醋酸钠三水合物（pH 4.5），以及26% (v/v) 聚乙二醇单甲醚550。
   • 数据收集： 将晶体在含有20%甘油的母液中速冻保护。X射线衍射数据在上海同步辐射光源（SSRF）的BL17U线站收集，温度为100 K。所有衍射数据使用HKL2000软件进行处理。

3. 结构解析与精修：

   • 相角解析： 采用分子置换法解析相位。以已知的、同属于内罗病毒科的SFTSV Gc蛋白融合后结构（PDB代码：5G47）作为搜索模型，使用CCP4程序包中的Phaser进行分子置换。
   • 模型构建与精修： 初始模型经过Refmac5进行限制性刚体精修，随后在Coot中进行手动模型构建和调整。最终的精修使用Phenix完成。使用Procheck评估最终模型的立体化学质量。
   • 数据提交： 最终结构坐标已提交至蛋白质数据库（PDB），代码为5YOW。

4. 结构比对与数据分析：

   • 比对对象： 将解析出的HRTV Gc融合后结构，与已发表的SFTSV（内罗病毒科）、HTNV及PUUV（汉坦病毒科）的Gc融合后结构进行详细的结构比对。
   • 分析方法： 使用专业的结构分析软件（如PyMOL）进行三维结构叠合，计算均方根偏差（RMSD），分析结构域取向、二硫键模式、糖基化位点、原体间相互作用、融合环构象等细节特征。同时，也与其他已知的II类融合蛋白（如登革病毒E蛋白、蜱传脑炎病毒E蛋白、塞姆利基森林病毒E1蛋白、风疹病毒E1蛋白）的结构特征进行横向比较。

三、 主要研究结果 研究成功解析了HRTV Gc胞外域在pH 4.5条件下的晶体结构，分辨率为2.1 Å。结构显示其为典型的三聚体融合后构象。

1. HRTV Gc的整体结构与家族内保守性：

   • HRTV Gc呈现经典的II类融合蛋白折叠模式：一个由13条β链（标记为a0至m0）组成的中心β-三明治结构（结构域I），其两侧延伸着细长的结构域II和一个免疫球蛋白样模块的结构域III。结构域II包含两个亚结构域：一个六链β-片层和一个五链β-三明治。
   • 与同属内罗病毒科的SFTSV Gc结构进行叠合显示，两者整体结构高度一致（RMSD为1.010 Å），证实了在同一病毒科内Gc蛋白结构的保守性。

2. 结构域III的取向具有病毒科特异性：

   • 当以结构域I为参照进行叠合时，内罗病毒科（HRTV和SFTSV）与汉坦病毒科（HTNV和PUUV）的Gc蛋白在结构域III的取向上呈现显著差异（HRTV与HTNV的RMSD为4.600 Å）。
   • 内罗病毒科的Gc在从融合前到融合后构象变化过程中，结构域I的构象发生显著改变，而结构域III围绕结构域I/III交界处旋转约75.1°。相比之下，汉坦病毒科的Gc在构象变化中，结构域I的构象相对类似，但结构域III的旋转幅度更大，达到约132.6°。结构域II围绕结构域I/II交界处的铰链旋转角度在两个科中相近（约26°）。
   • 拓扑学分析进一步揭示，内罗病毒科Gc结构域I中特有的β-链m0，以反平行方式与链c0相互作用，是连接结构域I和III的桥梁元件，对决定结构域III的取向起关键作用。而汉坦病毒科的Gc缺乏此特征。

3. N-连接糖基化模式的科间差异：

   • HRTV Gc有三个预测的N-糖基化位点（N857， N918， N940），但在结构中仅在N940（位于结构域III）观察到了糖基修饰。这些糖链与同一原体中结构域I的K625、K627和E739等残基发生相互作用，起到了稳定结构域I和III之间界面的作用。SFTSV Gc的对应位点（N937）也观察到类似情况，尽管糖链细节略有不同。
   • 相反，在两个汉坦病毒科的Gc结构中（HTNV和PUUV），观察到的糖基化位点位于结构域II（HTNV N928， PUUV N937）。更重要的是，这些糖链并非与自身原体相互作用，而是与相邻原体的结构域III发生氢键作用。
   • 这表明，内罗病毒科的糖基化位点（在结构域III）主要参与稳定同一原体内部的结构，而汉坦病毒科的糖基化位点（在结构域II）则参与介导原体间的相互作用，这种差异反映了融合蛋白组装策略的科间特异性。

4. 原体间相互作用的模式不同：

   • 在融合后三聚体中，内罗病毒科（HRTV和SFTSV）的Gc蛋白原体间仅存在部分相互作用，具体表现为一个原体的结构域I中的β-链a0与相邻原体结构域I中的β-链m0之间形成两个氢键。
   • 而汉坦病毒科（HTNV和PUUV）的Gc则表现出更广泛的交叉原体相互作用，一个原体的β-链a0与相邻原体的β-链b0平行排列，这与风疹病毒E1蛋白的相互作用模式类似。其他II类融合蛋白如登革病毒E蛋白则没有此类原体间相互作用。
   • 这种差异可能与N端结构的稳定性有关。内罗病毒科Gc的N端由一个保守的二硫键（Cys567-Cys608）稳定，限制了其灵活性。而汉坦病毒科Gc的N端没有形成二硫键，β-链a0更具柔性，从而允许更大幅度的重排和链交换，这可能解释了两个科在融合过程中亚基排列方式的根本区别。

5. 融合环构象的保守性与差异性：

   • Gc蛋白的融合环位于结构域II的顶端，包含多个环区（如bc环、cd环、ij环）。
   • 在内罗病毒科中，融合环在融合前（如RVFV）和融合后（HRTV， SFTSV）构象中无明显变化。这得益于其保守的二硫键模式，其中一个二硫键将环区与β-链固定在一起，锁定了融合环的构象。
   • 而在汉坦病毒科中，融合环的二硫键位于环与环之间（如Cys745-Cys780连接ab环和bc环，Cys775-Cys905连接bc环和ij环），结构不如内罗病毒科稳定。值得注意的是，在HTNV Gc的融合前结构中，其cd环及邻近区域是无序的，表明其具有较高的灵活性。这种构象差异可能影响两个科病毒膜融合的初始步骤和动力学。

四、 研究结论与意义 本研究成功解析了新兴病原体Heartland病毒（HRTV）Gc糖蛋白的融合后晶体结构。通过与同科（内罗病毒科）及不同科（汉坦病毒科）的布尼亚病毒Gc结构进行深入比较，揭示了在结构域III取向、N-糖基化位点功能、原体间相互作用模式以及融合环构象稳定性等方面存在显著的“家族特异性”差异。

这些结构差异并非偶然，它们很可能对应着内罗病毒科与汉坦病毒科在病毒进入宿主细胞过程中，膜融合蛋白具体的构象变化路径、亚基组装方式以及功能调控机制上的根本不同。因此，本研究从原子层面为国际病毒分类委员会（ICTV）将布尼亚病毒目划分为不同的科（特别是区分内罗病毒科和汉坦病毒科）提供了强有力的结构生物学证据和支持。

科学价值： 1. 深化分类学理解： 将病毒分类从传统的基于血清学、基因序列层面，推进到基于关键功能蛋白三维结构差异的层面，使分类体系更具功能与进化意义。 2. 揭示分子机制： 详细阐述了布尼亚病毒不同科之间膜融合机制的异同，为了解这类重要病原体的入侵过程提供了关键的分子细节。 3. 提供结构框架： HRTV Gc的结构为后续针对该病毒或其所属病毒科的疫苗设计（如靶向Gc的中和抗体筛选）和抗病毒药物开发（如设计抑制膜融合的小分子）奠定了重要的结构基础。

应用价值： 1. 为新发传染病防控提供靶点： 对HRTV、SFTSV等新发高致病性病毒Gc蛋白的结构解析，有助于识别保守的、关键的脆弱位点，为开发广谱性疫苗或 therapeutics（治疗剂）指明方向。 2. 指导跨科比较研究： 研究所确立的结构比较范式，可用于研究布尼亚病毒目其他科（如内罗病毒科、白纤病毒科等）的膜融合蛋白，系统阐明整个病毒目的入侵机制多样性。

五、 研究亮点 1. 关键结构的首次解析： 首次报道了新兴病原体Heartland病毒（HRTV）Gc糖蛋白的高分辨率融合后结构，填补了该病毒结构生物学研究的空白。 2. 提出并验证“家族特异性”概念： 研究超越了单个病毒的结构描述，通过系统的科间比较，明确提出了布尼亚病毒Gc蛋白的结构特征具有“家族特异性”，并将这一概念与具体的结构细节（结构域取向、糖基化、原体相互作用）紧密关联，为病毒分类学提供了新颖且坚实的结构标准。 3. 机制阐释深入： 不仅描述了结构差异，还深入探讨了这些差异可能导致的生物学后果（如N端二硫键对原体相互作用的约束、糖基化位点位置对稳定性的影响、融合环二硫键模式对构象灵活性的调控），将静态结构分析与动态功能推测有机结合。 4. 技术严谨性： 研究采用了成熟可靠的结构生物学方法，数据质量高（2.1 Å分辨率），模型构建与精修过程严谨，结构分析全面，与多种已知结构进行对比，结论可信度高。

六、 其他有价值内容 研究在讨论部分还提及了可能的pH传感机制。通过比对，发现内罗病毒科（如SFTFV中的H940， HRTV中对应保守，RVFV中的H1087）和汉坦病毒科（如HTNV中的H1038）的Gc蛋白结构域III中均存在保守的组氨酸残基。这些位于关键位置的组氨酸可能在低pH触发构象变化中充当质子传感器，但具体功能有待后续突变体功能实验验证。这为进一步研究布尼亚病毒膜融合的触发机制提供了线索。

此外，研究观察到在体外溶液中，HRTV Gc以及其他已研究的布尼亚病毒Gc（如SFTSV、RVFV、PUUV、HTNV）在酸性和中性pH下均以单体形式存在，而三聚体仅能在结晶条件或脂质体存在下的低pH溶液中获得。这一现象提示，Gc蛋白在天然状态下的寡聚化可能依赖于特定的膜环境或与其他病毒组分的相互作用，这值得未来利用更接近天然状态的体系（如病毒样颗粒或全病毒冷冻电镜）进行深入研究。