人类胆固醇转运蛋白ABCG1的结构与运输机制研究学术报告

一、研究团队与发表信息
本研究由来自中国科学技术大学生命科学与医学部的Da Xu、Yanyan Li、Wen-Tao Hou、Cong-Zhao Zhou和Yuxing Chen等学者共同完成，于2022年1月25日发表于期刊*Cell Reports*（论文编号：110298）。研究通过冷冻电镜技术解析了人类胆固醇转运蛋白ABCG1的三维结构，揭示了其介导胆固醇外排的分子机制。

二、学术背景
胆固醇是哺乳动物细胞膜的关键成分，参与维持膜流动性及胆汁酸、类固醇激素的合成。胆固醇稳态失衡会导致动脉粥样硬化等疾病。反向胆固醇转运（Reverse Cholesterol Transport, RCT）途径是清除外周组织多余胆固醇的核心机制，其中ABCG1作为关键转运蛋白，负责将细胞内的胆固醇转运至新生高密度脂蛋白（HDL）。然而，ABCG1的结构及其运输胆固醇的具体机制长期未知。本研究旨在通过结构解析与功能实验，阐明ABCG1的工作机制，为动脉粥样硬化的治疗提供新靶点。

三、研究流程与方法
1. 蛋白表达与纯化
- 研究对象：全长人类ABCG1（678个氨基酸），在HEK 293F细胞中过表达，通过C端Flag标签纯化。
- 样本处理：细胞膜提取后，使用去垢剂LMNG（月桂基麦芽糖新戊二醇）和CHS（胆固醇半琥珀酸酯）溶解蛋白，经抗Flag亲和层析和尺寸排阻色谱纯化。
- 创新方法：将ABCG1重构至纳米脂盘（nanodiscs）中以模拟生理膜环境，用于后续功能实验。

1. 冷冻电镜结构解析

   • 样本制备：ABCG1与ATP孵育后，通过冷冻电镜（cryo-EM）采集图像，使用Relion 3.1和CryoSPARC 3.2软件进行三维重构，最终获得3.26 Å分辨率的结构。
     
   • 结构特征：捕获到ABCG1与胆固醇、鞘磷脂（sphingomyelin）及ATP结合的内向构象（inward-facing conformation），揭示了跨膜腔内的底物结合位点。
     

2. 功能实验

   • ATP酶活性测定：野生型ABCG1在纳米脂盘中显示基础ATP酶活性（80.2 nmol/min/mg），胆固醇刺激后活性显著提升（EC₅₀=1.98 μM）。催化突变体E242Q活性大幅降低。
     
   • 胆固醇外排实验：转染ABCG1的HEK 293T细胞中，胆固醇外排至HDL的效率显著高于脂质游离的载脂蛋白A-I（apo A-I），突变体（如F467A、F567A）外排能力下降。
     
   • 质谱分析：通过串联质谱（MS/MS）鉴定出与ABCG1共纯化的鞘磷脂（d34:1），证实其参与胆固醇结合。
     

3. 突变体验证

   • 关键残基突变：针对胆固醇结合腔（如Phe467、Ile574）和鞘磷脂结合位点（如Arg213、His424）设计突变体，通过Western blot和功能实验验证其对运输活性的影响。
     

四、主要研究结果
1. ABCG1的三维结构
- 结构显示ABCG1为同源二聚体，形成内向开放的跨膜腔，腔内结合两个胆固醇分子和两个鞘磷脂分子。胆固醇的羟基与Pro570形成氢键，疏水链由Phe467、Ile574等残基固定。
- 鞘磷脂的酰基链与胆固醇平行排列，其极性头被His171、Arg213等残基包围，证实鞘磷脂对胆固醇招募的辅助作用。

1. 运输机制的关键发现

   • 疏水出口：跨膜腔出口由三对苯丙氨酸（Phe460、Phe582、Phe583）构成“疏水路径”，突变这些残基会显著抑制胆固醇外排。
     
   • ATP驱动的构象变化：尽管结构为内向构象，ATP结合诱导的构象变化为外向开放状态提供了基础，而HDL作为胆固醇受体完成外排循环。
     

2. 功能验证数据

   • 胆固醇刺激下，ABCG1的ATP酶活性提升至169.4 nmol/min/mg（Vₘₐₓ），且外排效率与HDL浓度正相关。
     
   • 鞘磷脂结合位点突变体（如R213A、H424A）的胆固醇外排活性降低50%以上，质谱显示其鞘磷脂结合量减少。
     

五、研究结论与意义
1. 科学价值
- 首次解析ABCG1的三维结构，提出“鞘磷脂辅助胆固醇招募→ATP驱动构象变化→疏水路径释放”的运输模型。
- 阐明了ABCG1与同家族转运蛋白（如ABCG2）的底物特异性差异，为理解ABCG亚家族的功能分化提供依据。

1. 应用前景
   
   • 靶向ABCG1的胆固醇结合腔或疏水出口的小分子，可能成为调控动脉粥样硬化的潜在药物。
     
   • 鞘磷脂的辅助作用提示，调节膜脂组成或可增强胆固醇外排，为代谢疾病治疗提供新思路。
     

六、研究亮点
1. 结构创新：首次捕获ABCG1与胆固醇、鞘磷脂的复合物结构，揭示了多脂质协同的运输机制。
2. 方法学贡献：结合冷冻电镜、纳米脂盘重构及脂质组学，建立了膜蛋白功能研究的综合技术流程。
3. 生理意义：发现鞘磷脂对胆固醇外排的必需性，解释了既往实验中鞘磷脂依赖性活性的分子基础。

七、其他价值
研究还探讨了ABCG1在肿瘤免疫中的作用（如文献引用Namba et al., 2018），提示其可能作为肿瘤标志物或治疗靶点，为后续跨领域研究提供线索。