工业级产黄青霉发酵过程中耦合溶解氧与葡萄糖浓度动态的代谢-流体动力学模型构建与放大缩小设计

作者: Peng Wei, Cees Haringa, Luis M. Portela, Henk J. Noorman 发表期刊: Chemical Engineering Science 发表时间: 2023年4月23日在线发表

本文报道了一项针对工业规模青霉素发酵过程中，葡萄糖与溶解氧浓度梯度对微生物代谢耦合影响的计算流体力学-细胞反应动力学研究。该研究由荷兰代尔夫特理工大学（Delft University of Technology）与皇家帝斯曼（Royal DSM）的科研团队合作完成，发表在期刊 Chemical Engineering Science 第276卷上。研究的核心目标是构建并验证一个整合了溶解氧动态的工业级发酵模型，并以此为基础设计一个能够精确模拟工业规模环境异质性的放大缩小模拟器。

研究背景与研究目的

在工业规模的发酵过程中，微生物的性能常常受到环境因素的影响，尤其是底物和溶解氧浓度的分布不均。在大规模发酵罐中，这些因素的分布具有空间异质性，微生物在其运动轨迹中会经历剧烈的环境变化，这种“生物体生命线”上的波动会直接影响生物过程的整体速率和产量。传统的放大缩小模拟器是研究此类梯度影响的常用工具，但其设计和操作往往未能充分重现实际工业环境中由计算流体力学模型所预测的快速波动。此前的研究成功构建了预测工业规模（54立方米）青霉素发酵罐中底物分布的计算流体力学-细胞反应动力学模型，并揭示了微生物在数秒内经历的葡萄糖吸收率的快速波动。然而，这些模型为了简化，假设氧气在整个过程中是充足的、非限制性的。尽管有实验研究表明，溶解氧浓度过低会显著抑制甚至导致青霉素生产的不可逆损失。因此，本研究的首要目的是将氧气的传递与消耗过程整合进已有的计算流体力学-细胞反应动力学框架中，系统性地研究氧气梯度对底物吸收和青霉素生产的耦合影响。其次，研究旨在基于这些新的认知，设计一个既能准确反映工业规模系统特征，又具有实验可操作性的新一代放大缩小模拟器，以弥补现有模拟器在复制快速环境波动方面的不足。

研究流程与具体方法

本研究的工作流程主要分为两大部分：工业级模拟与基于模拟数据的放大缩小模拟器设计。

第一部分，工业规模建模与模拟。研究团队基于一个有效体积为54立方米、配备两个Rushton搅拌桨的工业级青霉素发酵罐构建计算流体力学模型。该模型采用欧拉-欧拉双流体方法模拟气液两相流，其中液相属性被简化为与水的属性相似。搅拌桨区域的模拟采用了滑移网格法，湍流模拟则选用可实现的k-ε模型配合分散湍流多相模型。气相部分假设为理想气体且具有统一的气泡尺寸（6.4毫米），两相间的曳力通过Grace模型求解。在模型的数值求解上，研究采用了三阶精度的对流动力学二次插值离散格式，以确保计算精度。氧气的相间传质是基于一种混合传质假设，即在低湍流区采用渗透理论，而在高湍流区采用表面更新理论来计算传质系数，并取其较大者作为局部传质系数。

代谢动力学方面，本研究整合了两种葡萄糖与氧气耦合的吸收动力学模型：一个是Tsao & Hanson模型，该模型通过两个相乘的Monod方程形式来耦合底物与氧气的消耗，意味着葡萄糖和氧气的吸收是相互依赖的；另一个是Roels模型，该模型通过计算葡萄糖和氧气分别支持的最大比生长速率，并取其最小值来限制整体代谢速率。这些动力学参数从一个不同的产黄青霉代谢研究中获取。为了追踪微生物在发酵罐内的运动轨迹，研究采用了欧拉-拉格朗日法。20000个被视为无质量流体质点的微生物粒子被追踪了900秒的流动时间，这个时间长度超过了所模拟生物反应器95%混合时间的10倍，采样时间步长设置为0.03秒，以此来获得具有统计学意义的微生物“生命线”数据，这些数据记录了每个微生物个体随时间推移所经历的葡萄糖和溶解氧浓度的动态变化。

第二部分，基于“生命线”数据的放大缩小模拟器设计。研究人员首先重新定义了代谢状态区间。基于影响青霉素产量的溶解氧和葡萄糖的关键阈值，将微生物的代谢环境划分为六种耦合的代谢状态区间：例如，“l+”代表葡萄糖限制但氧气充足的区间，“l-”代表葡萄糖和氧气双限制的区间等。接着，通过对工业级模拟获得的“生命线”数据进行统计分析，确定了这些代谢区间的停留时间分布和六种主要的区间转换模式，并解析了各个转换模式中葡萄糖和氧气浓度变化的特征，以及这些模式间的逻辑连接顺序。最后，研究团队提出了三种逐步优化的放大缩小模拟器设计方案，均采用单反应器恒化器模式。第一种方案(SD-a)试图通过随机化和高频率地切换葡萄糖和氧气的供给来最高保真度地重现“生命线”数据的所有动态特征。第二种方案（SD-b）是从现有实验室标准操作出发，采用较低的生物量浓度（6 g/L）和较长的循环周期（360秒），但其无法复现工业级的快速波动。第三种方案（SD-c）是作为折衷提出的新设计方案，旨在权衡数据代表性与实验可操作性。SD-c采用了一个包含六个步骤的周期循环，每个步骤的频率和时标都依据CFD数据的统计结果设定，以重现关键的区间转换模式，设计方案要求相对较高的生物量浓度（20 g/L），并通过葡萄糖和空气供应的周期性开关操作来实现快速的浓度波动。

主要研究结果与分析

工业级模拟的结果揭示了葡萄糖和溶解氧梯度的显著耦合效应。在应用Tsao & Hanson模型对常规进料速率的模拟中，发酵罐内未曾出现葡萄糖过量区间（e+或e-），同时出现了近15%体积分数的溶解氧限制区间（l-），这对青霉素生产是有害的。这是因为在进料口所在的顶部区域，虽然葡萄糖浓度高，但耗氧速率也随之增高，加之该区域因远离底部通气口和静压差导致的较低的氧气溶解度，造成了局部溶解氧浓度低于临界值，从而反过来抑制了葡萄糖的吸收，防止了其饱和。与假设氧气无限充足的场景相比，这种耦合作用尽管改善了葡萄糖在整个罐内的分布（减少了饥饿区间s+），但由于过量区间的消失（该区间可减轻葡萄糖对青霉素合成途径的抑制），最终预测的青霉素稳定生产率下降了约5%。相比之下，Roels模型由于假设葡萄糖和氧气的吸收互不直接影响，因此预测到了葡萄糖过量区间的存在。

对“生命线”数据的分析表明，微生物经历的耦合环境转换极为迅速，时间尺度在十秒到百秒级之间，形成了六种主要的区间转换模式。例如，模式1是微生物在顶部氧气限制区（l-）和中部氧气恢复区（l+）之间的频繁振荡；模式2则是在底部的葡萄糖饥饿区（s+）和中部的限制区（l+）之间切换；而模式3和5则是在整个罐高范围内、跨越多个区间的大循环。这些模式的停留时间分布基本遵循指数衰减规律，表明在各个代谢区间内的流体行为具有循环流动的特征。这些动态特性成为后续模拟器设计的核心依据。

在对放大缩小模拟器的评估中，传统的SD-b设计方案，即便经过优化，也无法匹配工业级模拟获得的代谢区间分布，且由于其低生物量浓度和大循环周期，完全无法重现秒级的浓度波动，这暴露了传统模拟方法的内在局限性。为解决此问题而设计的SD-c方案，通过精心编排的六步操作周期，成功地以周期性循环的方式近似了CFD数据的统计特征。其模拟结果显示，预测的代谢区间分布与工业级CFD数据的偏差小于4%，并能产生与工业规模相似的高频振荡的葡萄糖和溶解氧“生命线”图谱。然而，SD-c的实现需要极为复杂的操作，如频繁地开关葡萄糖和空气供应，并且对执行器的响应速度和控制的精确度提出了很高的要求。研究还发现，实现这些快速波动需要维持较高的生物量浓度，如果降低浓度，浓度变化的幅度和频率都会变得平滑，无法跨越关键的代谢阈值。作为一种替代方案，研究也初步探讨了多隔室反应器（如四隔室的连续搅拌釜式反应器和平推流反应器组合），但发现其系统复杂性和潜在的操作问题（如剪切力损伤、传输管路中的氧耗竭）使其并不比SD-c更具优势。

研究结论与价值

本研究成功地将氧气动态整合到工业级青霉素发酵的计算流体力学-细胞反应动力学模型中，并从一个工业级（54立方米）产黄青霉发酵罐的模拟结果中，明确揭示了葡萄糖和溶解氧浓度梯度的耦合作用及其对微生物代谢和抗生素生产的显著影响。研究的一个关键科学发现是，氧气限制能够重塑葡萄糖的吸收分布，从而影响青霉素的生产率，这强调了在生物过程模型中同时考虑多种关键底物限制的必要性。

研究的应用价值在于，它为放大缩小模拟器的理性设计提供了全新的、基于严格数据的范式。研究不仅指出了传统实验模拟器在捕捉工业级环境波动方面的固有不足——即通常使用的分钟级循环无法代表真实的秒级动态，还提出了具有开创性的精密缩微模拟器（SD-c）设计。尽管该设计在当前技术条件下面临实施挑战，但它清晰地指明了未来发酵过程放大缩小研究的改进方向：必须开发能够实现和控制秒级甚至更短时间尺度环境波动的新型实验装置，例如基于微流控技术的微观生物反应器。这一洞见对于弥合实验室研究与工业实践之间的鸿沟，实现发酵过程的精准优化和高效放大具有重要的指导意义。此外，研究还通过灵敏度分析，揭示了气液传质模型参数（如搅拌速度、气泡大小、流变特性）对预测氧气梯度的重大影响，呼吁未来工业界加强对这些参数的实验量化工作。

研究亮点

本研究的亮点主要体现在三个方面。第一，方法创新：首次将氧气耦合的代谢动力学与欧拉-拉格朗日计算流体力学模型结合，用于工业级真菌发酵过程模拟，实现了对微生物个体所经历的葡萄糖和溶解氧双重环境历史的同步追踪。第二，发现新颖：揭示了由于进料和通气位置相反所导致的自上而下的葡萄糖梯度和自下而上的溶解氧梯度形成的动态消长模式，并发现了这种耦合如何消除葡萄糖过量区并最终影响生产率的非直观机制。第三，设计前沿性：提出了一个极具前瞻性的精密放大缩小模拟器（SD-c）设计方案，该方案不仅与工业级数据高度吻合，其对高频、大幅值操作波动的需求更是向现有生物反应器技术发起了挑战，为下一代放大缩小技术的研发设定了明确的技术规格和性能目标。