这篇发表于学术期刊《Catalysts》2025年12月第15卷第1127期的文章，是一篇题为“Advances in Strategies for In Vivo Directed Evolution of Targeted Functional Genes”的综述论文。作者Hantong Wu、Lang Yin、Jingwen Chen、Xin Wang和Kequan Chen均来自中国南京工业大学生物技术与制药工程学院、材料化学工程国家重点实验室。该论文系统地总结了近年来体内定向进化（In Vivo Directed Evolution）策略的重要进展，特别是那些能够实现靶向基因高效、连续突变的技术平台。

综述主题与背景 论文的核心主题是“体内定向进化策略的进展”。在生物技术、医药和工业制造领域，酶作为具有高特异性和高效率的生物催化剂发挥着不可或缺的作用。然而，天然酶在应用于非天然底物、极端工业条件或需要拓宽底物谱时，往往存在活性低、稳定性差等局限性。定向进化（Directed Evolution）作为模拟自然进化过程的关键蛋白质工程策略，通过引入遗传多样性并结合定向筛选，已成为克服这些局限性的主要手段。

传统的定向进化通常涉及体外构建突变库、转化、高通量筛选等多个独立且耗时的步骤，效率受到DNA转化瓶颈和筛选通量的严重制约。近年来，随着合成生物学的飞速发展，一系列将突变、翻译、筛选和复制过程整合于活细胞内的“连续体内进化平台”应运而生。这些平台能够实现自动化、连续多代的基因优化，显著提高了实验效率，代表了定向进化技术的前沿方向。本文旨在系统梳理这些核心策略，分析其应用，并展望未来挑战与机遇。

论文的主要论点与论据

1. 体内定向进化的两大核心策略：靶向基因超突变与异源聚合酶介导的靶向超突变 文章开篇即指出，成熟的体内进化平台主要围绕两大核心策略构建：体内靶向基因超突变和异源聚合酶介导的靶向超突变。

• 体内靶向基因超突变 侧重于在细胞内对特定基因或基因簇进行高效、持续的突变，同时尽量减少对宿主基因组的脱靶效应。其早期灵感来源于对大肠杆菌DNA聚合酶I的研究，通过工程化改造获得高错配变体，可特异性地靶向质粒DNA进行超突变。这一思路催生了后续更为精密的系统。
• 异源聚合酶介导的靶向超突变 则利用与宿主原生复制机器正交（不相互干扰）的复制系统。通过引入来自噬菌体或酵母质粒的异源DNA聚合酶，并对其进行工程化改造以降低其保真度，使其能够专门复制携带特定复制子的外源质粒，从而在复制循环中持续向目标基因引入突变。这种策略能最大程度地保护宿主基因组稳定性。

2. 噬菌体辅助连续进化及其衍生平台 噬菌体辅助连续进化是早期具有里程碑意义的连续进化策略。该系统的核心设计是将目标基因整合到删除必需基因pIII的噬菌体基因组中，而pIII基因的表达被置于宿主辅助质粒上，并由目标基因编码的蛋白活性控制。只有产生功能性目标蛋白的噬菌体变体才能表达pIII，从而完成感染周期并增殖。通过结合连续流生物反应器和错配倾向的诱变质粒，PACE可以在数百代内无需人工干预地连续进化目标分子。

文章详细列举了PACE的多个优化与衍生版本，作为其有效性和可拓展性的证据： * PANCE：将连续流改为分批传代培养，提高了操作的灵活性。 * PRANCE：整合了96孔板机器人液体处理平台和实时发光反馈，实现了数百个独立进化谱系的高通量平行进化。 * EPACE：结合了Evolver培养系统和微流控装置，支持在8种不同选择条件下进行自动化平行进化。 * SPACE：利用半固体琼脂上的细菌范围扩展和噬菌体空间竞争，无需复杂流体操控即可进行96个平行实验。 * Alt-PANCE：将突变阶段和选择阶段解耦，以减轻进化有毒基因时的适应性负担。 * IntePACE：采用分裂-pIII系统来进化具有高特异性的大片段整合酶。

然而，文章也指出，基于噬菌体的系统主要局限于原核生物宿主，这是其应用范围的一个关键限制。

3. 正交DNA复制系统在不同宿主中的发展 为了克服噬菌体系统的宿主限制，并实现更广泛的靶向诱变，研究人员开发了适用于不同宿主的正交DNA复制系统。文章通过表格和详细描述对比了多个系统的性能指标。

• OrthoRep（酵母正交系统）：利用来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒及其终端蛋白-DNA聚合酶1系统。通过工程化改造获得高错配变体，如tp-dnap1-4-2，其突变率比野生型提高10^5倍。后续通过启动子工程和添加遗传编码的poly(A)尾巴优化了表达系统，使其表达水平提升了43倍，并能稳定维持长达18 kb的DNA序列，适用于单基因和多基因途径的连续进化。
• 细菌正交系统：
  • BacOREP：基于苏云金芽孢杆菌和温和噬菌体Gil16元件构建，能在革兰氏阳性菌中实现靶向突变。
  • EcoRERP：专为大肠杆菌设计的合成正交系统，利用PRD1噬菌体复制系统，支持≥16.5 kb的大片段进化，并已成功应用于抗生素抗性和荧光蛋白的进化。
  • T7-Oracle：同样针对大肠杆菌，基于T7噬菌体复制起点，使用高错配T7 DNA聚合酶，突变率比基因组背景高10^5倍。其使用常规环形质粒，具有极高的转化效率，便于与标准分子生物学流程整合，特别适合大规模平行进化实验。

这些系统共同构成了一个多宿主、可靶向、对基因组影响最小的连续体内进化工具包。

4. 转录靶向突变系统 与基于DNA复制的策略不同，转录靶向突变系统将脱氨酶（如胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶）与噬菌体RNA聚合酶融合。该融合蛋白在转录目标基因时，能在转录泡内的非模板链上引入特异性碱基突变。

• MutaT7系统：最初的系统将胞苷脱氨酶与T7 RNA聚合酶融合，实现了以C→T和G→A为主的突变，且脱靶效应极低。
• eMutaT7：通过更换更高效的脱氨酶、使用诱导型启动子和优化连接肽，将突变率大幅提升。
• eMutaT7transition：共表达腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，实现了更平衡的突变谱。
• T7-DIVA：结合了CRISPR-dCas9作为转录“路障”，可在不插入终止序列的情况下精确限定突变范围，实现了极高的靶向特异性。
• 在非模式微生物中的扩展：文章指出，MutaT7系统已成功在谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌中实现，并开发了正交转录突变系统，使用多种噬菌体RNA聚合酶，拓宽了在非模型工业微生物中的应用。
• 在真核生物中的应用：在酿酒酵母中发展的TRIDENT系统和人类细胞中的TRACE平台，均展示了突变率超过10^-3、靶向特异性超过1000倍的强大性能，为真核生物蛋白质工程提供了新工具。

5. 逆转录子与CRISPR/Cas介导的连续进化系统 * 逆转录子介导的系统：利用细菌逆转录子元件产生的多拷贝单链DNA作为内源性修复模板，可实现程序化、自主的连续进化。通过系统优化，该系统能在特定位点引入多达13个程序化核苷酸替换，或与错配T7 RNA聚合酶偶联，在特定区域引入非程序化的随机突变。 * CRISPR/Cas介导的系统：例如EvolVR系统，将催化受损的Cas9切口酶与工程化的错配DNA聚合酶融合。在sgRNA引导下，切口酶在靶点产生单链切口，融合的聚合酶在修复合成过程中引入随机突变。该系统已成功应用于大肠杆菌和酿酒酵母，实现了对多个基因位点的同时连续进化。针对大范围编辑需求开发的COMUTER平台，利用I-E型CRISPR-Cas3机器，可实现长达55 kb基因组区域的靶向突变。

6. 体内染色体超突变的应用实例 文章通过一个详细的表格，系统归纳了各类进化系统在酶和菌株性能定向进化中的成功应用案例，作为这些技术强大效能的实证。

• 酶的定向进化：
  • 使用OrthoRep进化氨酰-tRNA合成酶，实现非经典氨基酸的高效、高保真掺入。
  • 利用eMutaT7恢复功能受损的DegP蛋白酶活性，并发现新的变构激活位点。
  • 通过PACE进化出能识别T3启动子的T7 RNA聚合酶，以及能切割新底物的TEV蛋白酶变体。
  • 优化碱基编辑器，获得催化动力学提升590倍的腺嘌呤碱基编辑器TadA-8e。
• 菌株性能优化：
  • 进化β-内酰胺酶基因，获得对第三代头孢菌素的超高耐药性。
  • 在酵母和大肠杆菌中进化抗生素核糖体蛋白耐药基因。
  • 利用MutaT7进化L-高丝氨酸转运蛋白，提升菌株在高底物浓度下的生长能力。
  • 通过OrthoRep在酵母中模拟恶性疟原虫二氢叶酸还原酶的耐药性进化过程。
  • 使用OTM系统对细胞骨架和分裂基因簇进行靶向突变，在一天内实现对细胞形态的重新编程。

7. 当前挑战与未来展望 文章在最后部分客观地指出了该领域面临的挑战与发展方向： * 扩展宿主范围：当前平台主要集中于模式生物，未来需拓展至更多原核和真核宿主，尤其是具有工业应用潜力的非模式菌株。 * 多基因并行进化：复杂表型需要多个遗传元件的协同进化，开发能同时靶向多个基因组位点的系统是关键。 * 可扩展性与代谢负担：大型突变质粒和高活性突变机制可能带来代谢负担并扭曲选择结果。未来需开发最小化、染色体整合的突变系统，或利用高承载能力的稳定正交复制系统。 * 与人工智能结合：将连续进化产生的大规模突变数据与机器学习模型结合，可以预测有益突变、设计智能文库，从而将进化从随机探索引向智能引导。 * 工业转化：直接在强健的工业菌株中进行连续进化，有助于获得在真实应用环境中表现最优的变体。

论文的意义与价值 本篇综述具有重要的学术价值和指导意义。它不仅仅是对现有技术的罗列，而是进行了系统性的梳理、比较和机理分析，为研究人员提供了清晰的体内定向进化技术发展脉络和“技术图谱”。通过详细对比不同系统的原理、性能指标（如突变率、宿主、靶向长度、突变谱）和应用案例，文章帮助读者根据具体的研究目标和宿主体系选择最合适的技术平台。同时，文章对挑战和未来方向的深入探讨，为该领域的后续研究指明了潜在的突破口和创新点。因此，这篇综述是蛋白质工程、合成生物学和代谢工程领域研究人员一份极具参考价值的全面指南。