这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究的科学论文。以下为针对该研究的学术报告：
主要作者及机构
本研究由Rainer Stoffel（德国亥姆霍兹慕尼黑研究中心分析生物地球化学研究组）、Michael A. Quilliam（加拿大国家研究委员会生物毒素计量组）、Normand Hardt与Anders Fridström（德国默克公司）及Michael Witting（亥姆霍兹慕尼黑研究中心代谢组学与蛋白质组学核心实验室）合作完成，发表于《Analytical and Bioanalytical Chemistry》期刊2022年1月第414卷。
学术背景
研究领域：代谢组学（metabolomics）中的液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析。
研究动机：代谢物鉴定需结合质谱（MS/MS）与保留时间（retention time, RT）信息，但RT受色谱系统差异（如死体积、梯度延迟等）影响，难以跨实验室直接比较。尽管气相色谱（GC）已广泛采用保留指数（retention index, RI）标准化RT（如Kovats指数），但液相色谱（LC）缺乏普适性RI体系。
目标：验证N-烷基吡啶磺酸盐（n-alkylpyridinium sulfonates, NAPS）作为LC-MS中RI内标物的可行性，建立基于NAPS的RTI（retention time indexing）方法，提升代谢物注释准确性。
研究流程与实验设计
1. NAPS特性验证
- 研究对象：20种NAPS同系物（碳链长度C1-C20），其RI定义为碳原子数×100（如C15对应RI=1500）。
- 实验方法：
- 通过反相液相色谱-高分辨质谱（RP-LC-HRMS）分析NAPS的保留行为，验证其在正/负电离模式下的离子化效率及UV活性。
- 检测NAPS的多聚体形成（如[2M+H]+）及碎片离子（正模式m/z 160.0063，负模式m/z 79.9579），评估其适用于多反应监测（MRM）的潜力。
2. RI数据库构建
- 样本：>500种代谢物标准品（来自MSMLS库），合并为52组非异构体混合物以减少干扰。
- 色谱条件：
- 系统1（UHPLC-QTOF）：2.1×100 mm C18柱，0.3 mL/min流速，5-99.9%乙腈梯度。
- 系统2（HPLC-QTOF）：3.0×150 mm C18柱，0.4 mL/min流速，延长梯度时间。
- 数据处理：
- 使用metabocoreutils包（R语言）计算RI，对比线性插值、三次样条（spline）及Akima样条拟合效果。
- 通过“括号法”（bracketing NAPS标准品前后注射）校正RT漂移。
3. 方法验证
- 流速影响测试：在0.20-0.40 mL/min范围内调整流速，比较RT与RI的稳定性。
- 跨系统验证：对比UHPLC与HPLC系统的RI一致性，分析柱尺寸、死体积及梯度混合差异的影响。
- 生物基质应用：
- 在秀丽隐杆线虫（C. elegans）和小鼠血浆提取物中加标NAPS（稀释比1:20至1:80），评估离子抑制效应及RI重现性。
- 结合metaboannotation包匹配m/z与RI，注释代谢物（如色氨酸、核黄素）。
主要结果
NAPS作为RI内标的优势：
- 双电荷特性（吡啶阳离子与磺酸根）使其保留行为不受pH影响，且在正/负模式均可用。
- C4-C20 NAPS在测试条件下线性良好（R²>0.99），但C1-C3因接近死体积需优化色谱条件。
RI标准化效果：
- 流速变化导致RT差异达±50%，但RI偏差%（图2）。
- UHPLC与HPLC系统的RT差异达3分钟，而RI平均偏差仅0.25%（图3）。
生物样本中的应用：
- 1:80稀释NAPS可减少离子抑制（图4a），保留RI稳定性。
- 通过RI匹配成功注释4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid），排除其异构体（3-羟基苯甲酸与水杨酸）（表1）。
结论与价值
科学意义：
- 首次系统验证NAPS作为LC-MS中RTI内标的普适性，填补了代谢组学跨平台数据比较的技术空白。
- RI标准化可提升代谢物注释准确性，尤其对异构体（如羟基苯甲酸同分异构体）的区分。
应用价值：
- 为实验室间共享RT数据提供标准化工具，支持大规模代谢组学数据库构建。
- 未来可扩展至其他色谱体系（如HILIC），并与MS/MS谱图联合评分以优化鉴定流程。
研究亮点
- 方法创新：开发基于NAPS的RI计算算法（线性插值优先），开源R包metabocoreutils实现自动化。
- 跨平台验证：首次在UHPLC与HPLC系统间实现RI一致性（偏差%）。
- 实际应用：在复杂生物基质中验证NAPS的适用性，提出优化稀释方案以平衡灵敏度与抑制效应。
其他价值
- 提出NAPS多聚体（如[2M+Na]+）可作为质谱校准内标，扩展其应用场景。
- 数据开源（SI表格及R脚本），促进方法复现与改进。
（全文约2000字）