本文属于类型a，为单一原始研究论文。以下是对该研究的学术报告。
一、研究作者、机构与发表信息
本研究由A. Gala Morena、Arnau Bassegoda、Javier Hoyo和Tzanko Tzanov共同完成，通讯作者为Tzanko Tzanov。所有作者均来自西班牙加泰罗尼亚理工大学化学工程系分子与工业生物技术研究组。该研究于2021年3月23日在线发表于《ACS Applied Materials & Interfaces》期刊，卷号为13，页码为14885–14893，文献DOI为10.1021/acsami.0c22301。该研究得到了欧盟H2020-BBI-JTI-2017项目（项目编号792049）以及加泰罗尼亚大学与研究资助管理机构的博士奖学金支持。
二、研究背景与目的
本研究属于纳米生物技术、抗菌材料与绿色合成交叉领域。其核心科学问题是抗生素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的快速蔓延。由于抗生素的过度使用，细菌在选择性压力下不断产生耐药菌株，导致临床抗感染治疗失败率上升，美国和欧洲每年因AMR相关感染死亡人数分别达到3.5万和2.5万。因此，开发能够绕过传统耐药机制的新型抗菌剂成为迫切需求。
金属与类金属纳米颗粒（nanoparticles, NPs）因其非特异性多靶点抗菌机制而受到关注，可通过氧化损伤、破坏细菌脂质膜及抑制代谢酶等途径同时作用于多个细菌组分，从而降低耐药性演化的可能性。在众多金属纳米颗粒中，银纳米颗粒研究最为广泛，但已有研究报道细菌对银纳米颗粒产生耐药性，因此需要扩展金属纳米颗粒的种类。碲（tellurium, Te）因其对革兰氏阴性菌的毒性而逐渐受到重视，但传统化学合成碲纳米颗粒使用有毒还原剂，对人体细胞和环境均有害。已有绿色合成方法多依赖植物提取物，但此类方法可能会与食品和医药行业竞争资源。
本研究首次使用工业硫酸盐木质素（kraft lignin）作为还原剂，通过超声化学方法制备碲—木质素杂化纳米颗粒（TeLigNPs）。木质素是地球上第二丰富的生物聚合物，通常仅作为能源燃烧，很少以高分子形式被高值化利用。本研究旨在开发一种绿色、安全、可放大的合成策略，同时评价所得纳米颗粒对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的抗菌活性及其对人细胞的生物相容性，并探究其抗菌作用机制。
三、研究流程与方法
本研究共包括六个主要实验环节：TeLigNPs的合成、理化表征、抗菌活性评价、杀菌动力学、细胞毒性评价以及抗菌机制研究。
在合成环节中，研究者将Protobind 6000无硫硫酸盐木质素分散于水中（1% w/v），通过加入NaOH将pH调节至9以提高木质素溶解度。随后加入亚碲酸钠（sodium tellurite）至终浓度100 mM，所得溶液在20 kHz、50%振幅的超声波处理下，于60 °C反应30分钟。反应后通过25,000g离心30分钟纯化所得纳米颗粒，将沉淀重悬于超纯水中再次离心以彻底去除未反应的亚碲酸根离子。最后通过低强度超声使纳米颗粒分散，再以500g离心10分钟去除大颗粒和未溶解的木质素。整个合成过程为水相一步法，无需对原料进行化学修饰，反应条件温和。
在理化表征方面，研究者使用透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒形貌，并通过能量色散X射线光谱（EDX）进行元素分析。利用高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）获得化学元素分布图。使用ImageJ软件统计纳米颗粒尺寸分布。高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）用于分析碲簇的晶体结构。通过Zetasizer Nano Z测定纳米颗粒在水中的ζ电位。碲含量通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量，样品在分析前经20%硝酸于100 °C消解1小时。
在抗菌活性评价环节，研究者以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, ATCC 25923）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli, ATCC 25922）及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145）为测试对象。采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。将过夜培养的细菌用营养肉汤稀释至OD600=0.01，与不同浓度的TeLigNPs混合后在37 °C振荡培养24小时，通过测定OD600计算生长抑制率。通过平板计数法计算细菌存活数和对数减少值。杀菌动力学实验在0.60、1.20和2.39 ppm Te浓度下进行，在不同时间点取样并采用滴板法计数存活菌落。
在细胞毒性评价中，研究者使用人成纤维细胞（BJ-5ta）和人角质形成细胞（HaCaT）作为细胞模型。细胞以每孔60,000个的密度接种于96孔板，培养24小时后暴露于不同浓度的TeLigNPs 24小时，随后更换新鲜培养基恢复24小时。细胞活力通过AlamarBlue法测定，同时使用活/死细胞染色试剂盒结合荧光显微镜观察细胞形态。
在抗菌机制研究中，研究者使用氧化敏感探针H2DCFDA检测细菌和哺乳细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生。细菌培养至OD600约0.8后暴露于2.39 ppm Te的TeLigNPs 30分钟，离心洗涤后加入探针，通过荧光强度反映ROS水平。此外，研究者采用Langmuir单分子膜技术构建革兰氏阴性菌模型膜，以磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰甘油（PG）按8:2比例混合，在表面压力33 mN·m⁻¹条件下形成单层膜，通过注入TeLigNPs后记录表面压力变化来评价纳米颗粒对细菌膜的扰动能力。透射电子显微镜也用于观察细菌暴露于TeLigNPs后的超微结构变化，样品经戊二醛和四氧化锇固定、乙醇脱水、Spurr树脂包埋及超薄切片后观察。
四、主要研究结果
TeLigNPs的理化表征结果表明，所合成的纳米颗粒平均粒径为182±85 nm，ζ电位为-32.7 mV。TEM显示TeLigNPs由无定形基质和嵌入其中的多个电子致密球形簇组成。HR-TEM证实这些簇内存在明确的晶体结构域。EDX元素分布图显示碲主要定位于电子致密簇中，而氧信号集中于无定形基质，表明木质素不仅作为还原剂，还作为结构基质包裹碲簇。
抗菌活性结果显示，TeLigNPs在2.39 ppm Te浓度下可完全抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长，但对金黄色葡萄球菌仅达到13%的生长抑制。对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC分别为0.07和2.39 ppm Te，而相同Te浓度的亚碲酸盐不能抑制这些细菌的生长；亚碲酸盐对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC分别为0.31和15.60 ppm。平板计数实验表明，2.39 ppm Te的TeLigNPs处理24小时后，对大肠杆菌和铜绿假单胞菌分别实现了6.54和5.42对数减少，即100%和99.9995%的杀菌率。杀菌动力学显示，2.39和1.20 ppm Te的TeLigNPs在4小时内对大肠杆菌达到杀菌效果，24小时后完全根除；对铜绿假单胞菌，2.39 ppm Te的TeLigNPs在6小时实现杀菌，而低浓度仅表现为抑菌作用，且铜绿假单胞菌在初始减少后能够恢复生长。TEM超微结构分析显示，未处理的大肠杆菌表面光滑、胞质致密均匀，而经TeLigNPs处理的大肠杆菌出现胞质完整性丧失、细胞包膜破坏以及胞内内容物聚集等损伤。金黄色葡萄球菌暴露于TeLigNPs后未观察到形态学变化。
在生物相容性方面，在0.07至2.39 ppm Te的抗菌有效浓度范围内，TeLigNPs对人角质形成细胞和成纤维细胞的活力没有显著影响，荧光显微镜也未观察到细胞形态改变。只有当Te浓度提高至19.12 ppm（约为有效浓度的8倍）时才出现细胞毒性。这表明木质素基质的引入有效提高了碲纳米颗粒的生物相容性。
在抗菌机制方面，ROS检测结果表明，TeLigNPs处理可显著诱导大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生ROS，而金黄色葡萄球菌中未检测到ROS增加。在哺乳细胞中也未检测到显著的ROS产生，与细胞毒性结果一致。Langmuir单层膜实验显示，注入TeLigNPs后表面压力升高，表明TeLigNPs具有膜扰动活性。这种表面活性被归因于木质素组分，因为不同来源的木质素具有表面活性，而未稳定化的金属颗粒表面活性可忽略。
基于上述结果，研究者提出TeLigNPs对革兰氏阴性菌的杀菌机制假说：TeLigNPs通过其表面活性插入革兰氏阴性菌外膜的脂质双分子层，随后通过产生ROS引起膜脂质过氧化。脂质过氧化物分解为高反应活性的短链醛，扩散进入细胞质并氧化蛋白质的巯基和氨基，从而影响多种细胞代谢过程，最终导致细胞死亡。相比之下，革兰氏阳性菌具有较厚的肽聚糖细胞壁，可阻止TeLigNPs进入细胞膜，因此对其抗菌活性较低。
五、研究结论与价值
本研究首次报道了以工业木质素为还原剂和结构组分，通过超声化学方法绿色合成碲—木质素杂化纳米颗粒的策略。研究证明，将碲纳米化并嵌入木质素基质可显著提高其对革兰氏阴性菌的抗菌活性，在低于亚碲酸盐浓度的条件下即可实现完全杀灭大肠杆菌和铜绿假单胞菌。TeLigNPs在有效抗菌浓度下对人细胞无明显毒性，显示出良好的生物相容性。其双重抗菌机制包括膜扰动和ROS生成。
从科学价值看，本研究拓展了碲基纳米材料的绿色合成路径，阐明了木质素在纳米颗粒形成中的双重角色，并为理解碲基纳米颗粒的抗菌机制提供了实验依据。从应用价值看，TeLigNPs有望成为治疗革兰氏阴性菌感染的候选抗菌剂，尤其适用于抗生素耐药菌株的防治。然而，研究者也指出需要进一步开展体内研究以验证其治疗感染性疾病的潜力。
六、研究亮点
本研究的突出亮点包括：第一，首次将工业木质素用于碲纳米颗粒的合成，实现了废弃生物质的高值化利用；第二，采用超声辅助水相一步法，避免了有毒化学试剂的使用，符合绿色化学原则；第三，发现木质素作为结构基质可协同增强碲簇的抗菌活性，达到6.54对数减少的完全杀菌效果；第四，结合Langmuir单层膜技术、ROS检测和细菌超微结构观察，提出了较为完整的抗菌机制假说；第五，证明了TeLigNPs在有效抗菌浓度下对人体细胞的安全性，为后续生物医学应用奠定了基础。
七、其他有价值内容
研究所提供的支持信息包括亚碲酸盐对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制效果以及TeLigNPs和亚碲酸盐的MIC比较表。这些数据进一步支持了纳米化策略在提高碲抗菌活性方面的优势。此外，研究讨论部分涉及木质素相关化合物跨膜转运的文献分析，为解释TeLigNPs的膜插入行为提供了理论支持。研究者还明确指出，未来需通过体内实验验证TeLigNPs对感染性疾病的治疗效果，这为后续研究方向提供了明确指引。